小鼠皮下成瘤实验准3D类器官培养基质胶备程序

A、细胞房内材料准备、试剂制备及步骤

(1) 材料准备:

1. 冰盒、2. 37 ℃ 水浴槽、3. C 缓冲溶液(10X)、4. 无血清细胞培养液 (例如: 无血清 DMEM，DMEM-F12等，不可用 PBS )、5. A 胶 (2X)、6. 细胞培养液、7. 23-26G 针头、8. 1 mL 针筒、9. 细胞。

(2) 试剂制备:

1、C 缓冲溶液 (0.5 X) 制备 : 使用 37 ℃ 水浴回温的无血清细胞培养液 (例如: 无血清 DMEM 或DMEM-F12 等，不可用 PBS ) 稀释 C 缓冲溶液 (10 X) 至 C 缓冲溶液 (0.5 X), 即体积稀释 20 倍。使用前放置 37 度水浴槽。(例如:1 mL C 缓冲溶液 (10 X) + 19 ml 无血清 DMEM; 若未使用完毕，可先保存于4 ℃ 冰箱, 保存一周)

2、A胶 (1X) 制备 : 将 A胶 (2X) (货号:B-P-00003-A) 置于37 ℃ 水浴槽回温10分钟，确认*溶解。再将 37 ℃ 水浴回温的无血清细胞培养液取 0.5 mL，加至 37 ℃ 已溶解的 0.5 mLA胶 (2X)，配置成 1mL 的 A胶 (1X)。使用前置于37度，可降低黏度。 (单次使用，勿重复冷冻解冻 A胶 (1X) )

(3)步骤:

1、取细胞溶液离心后收集细胞沉淀，与C缓冲溶液 (0.5 X) 均匀混合使细胞浓度为3*106 cells/mL。

2、A胶 (1X) 与步骤 1 含 C缓冲溶液 (0.5 X) 的细胞系悬浮液，按照 2:1 比例均匀混合配置，细胞悬浮液最终浓度为 106 cells/mL。使用前置于37℃，可降低黏度。 (C缓冲溶液用于A胶凝胶反应，例如0.5ml C缓冲溶液(0.5 X)含细胞 加入 1ml A胶 (1X) 混合成1.5ml 的注射液)

3、选用 23-26 G 的针头 (建议选用 24 G) 及 1 mL 针筒，抽取 步骤2 A胶与 C缓冲溶液的细胞混合液至所需注射体积 (例如:0.2-0.6 mL) 。室温37℃至20℃操作抽取。 (若抽取时发生塞针状态，可先把针头拔掉，以针筒进行抽取，建议一次抽取配置好所需针筒数量，避免步骤2 溶液过度凝胶，发生塞针)

4、将抽取好步骤 3 的针筒，带入动物房, 若短时间无法施打建议置于冰上。

B、动物房内材料准备及步骤

(1)材料准备:

1. 含 A胶与 C缓冲溶液的细胞混合液的针筒、2. 皮肤消毒剂 (例如 : 酒精)、

3. 手套、4. 实验小鼠、5. 麻醉小鼠的试剂

(2)步骤:

1、室温下可直接注射。若是置于冰盒上的针筒，回到室温后，待液化再进行注射。 含 A胶与 C缓冲溶液的细胞混合液的针筒，以皮下注射方式，注射实验所需的体积至实验鼠 (建议皮下注射量为 0.2 mL，实际状况依需求而定)。(针筒放冰上注射阻力会上升, 放室溫会液化注射阻力小。注射时若因凝胶缘故而阻力变大，需缓慢注射避免针头喷落)

注1 : 注射体积可依不同实验目的做调整，若为皮下血管生成研究注射体积需至少0.5 mL以上。

注2 : 此步骤依实验需求可执行或不执行，若需呈现明显的皮下注射隆起效果，可调整2.试剂制备将C缓冲溶液 (10 X) 稀释15倍，变成C缓冲溶液 (0.66 X)，再执行后续成胶实验；提高C浓度，可提高胶体硬度。

2、培养一至三周后观察量测接种的肿瘤尺寸。

注 3 : 若为血管生成研究，应注射含 VEGF 及 heparin 的 A 胶，以促进血管生成。约三天后，可摘取含有新血管生成的肿瘤组织。