CCK-8检测细胞增殖和活力的原理、方法及注意事项

引言

Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）是一种广泛应用于细胞生物学研究中的试剂，主要用于简便而准确地检测细胞增殖和活力。CCK-8基于WST-8（化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐）的还原反应，通过生成高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）来反映活细胞的数量和活力。本文将详细介绍CCK-8检测细胞增殖和活力的原理、方法及注意事项。

原理

CCK-8试剂中的WST-8在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓（1-Methoxy PMS）的作用下，被细胞线粒体中的脱氢酶还原为水溶性的黄色甲瓒产物。这一还原反应与活细胞的数量和活力直接相关，生成的甲瓒物数量越多，表示活细胞数量越多，细胞活力越强。因此，通过测定甲瓒物的吸光度（OD值），可以间接反映细胞的增殖和活力情况。

方法

实验准备

1. 仪器与试剂：准备台式离心机、细胞计数仪、CO2培养箱、倒置显微镜、酶标仪（450nm滤光片）、CCK-8检测试剂盒、DMEM或其他培养基、双抗、FBS、PBS、DMSO等。

2. 细胞悬液制备：将对数生长期的细胞进行消化、离心、计数，并制备成适当浓度的细胞悬液。

实验步骤

1. 细胞接种：在96孔板中接种细胞悬液，每孔约100μL，细胞数量根据实验需求调整，一般贴壁细胞为3k-7k/孔，悬浮细胞可适当增加。将培养板放入培养箱中预培养24小时（37℃，5% CO2）。

2. 药物处理（如适用）：向培养板中加入不同浓度的待测药物或化合物，继续培养一定时间（如6、12、24或48小时）。

3. CCK-8检测：每孔加入10μL CCK-8溶液，注意避免产生气泡。将培养板放入培养箱中孵育1-4小时。

4. 吸光度测定：使用酶标仪在450nm处测定各孔的吸光度（OD值）。

5. 数据处理：根据OD值计算细胞存活率或抑制率，公式为：细胞存活率 = [(实验孔 - 空白孔) / (对照孔 - 空白孔)] × 100%；抑制率 = [(对照孔 - 实验孔) / (对照孔 - 空白孔)] × 100%。

注意事项

1. 细胞数量：细胞数量过低会影响检测结果的准确性，建议预先摸索合适的细胞接种数量。

2. 气泡干扰：加样过程中避免产生气泡，气泡会干扰OD值的读数。

3. 培养板边缘孔：培养板最外一圈的孔容易干燥挥发，建议只加培养基，不作为测定孔用。

4. 药物影响：如果待测药物具有氧化还原性，可在加入CCK-8之前更换新鲜培养基，以去除药物影响。

5. CCK-8保存：CCK-8试剂应保存在4℃或-20℃避光条件下，避免反复冻融。

6. 波长选择：对于高浑浊度的细胞悬液，建议采用双波长测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。

结论

CCK-8作为一种简便、快速、准确的细胞增殖和活力检测试剂，在细胞生物学研究中具有广泛应用。通过掌握其检测原理、方法及注意事项，可以确保实验结果的准确性和可靠性。未来，随着技术的不断发展，CCK-8将在更多领域发挥其重要作用。

参考文献

1. Bao K, Li Y, Wei J, et al. Fangchinoline suppresses conjunctival melanoma by directly binding FUBP2 and inhibiting the homologous recombination pathway. Cell Death Dis. 2021;12(4):380.

2. Pu X, Ye Q, Cai J, et al. Typing FGFR2 translocation determines the response to targeted therapy of intrahepatic cholangiocarcinomas. Cell Death Dis. 2021;12(3):256.