预染蛋白marker常见问题及解决方法
时间：2023-02-08 阅读：472
Q1:我
*查使用的凝胶类型/凝胶百分比。可能会由于凝胶类型和/或百分比的不同而不能看到所有条带。例如，蛋白质标准品的最小条带可能不能在非常低百分比的凝胶上分辨，而较高分子量条带可能不能在高百分比凝胶上分辨。
*检查蛋白质分子量标准品的有效日期。由于蛋白质降解，过期批次可能导致条带褪色或缺失。
*检查蛋白质分子量标准品的储存条件。不适当的储存条件会损害标准品中蛋白质的稳定性。
*确保蛋白质分子量标准品在上样到凝胶上之前未加热/煮沸。我们的蛋白质分子量标准品可直接上样，我们不建议将其加热/煮沸，因为这可能会导致标准品中的蛋白质降解。
*上样时，请注意确保相邻样品泳道没有交叉污染。
*确保每个泳道上标准品的量都是正确的。蛋白质上样过多会导致产生额外的条带，这个问题在使用银染凝胶时尤为突出。
*标准品储存不当或反复冻融会导致蛋白质降解。
*降低电压、电流或缩短转印时间
*确保转膜缓冲液的甲醇浓度合适；可使用浓度为10–20%的甲醇，从而去除SDS-蛋白质复合物中的SDS，并促进蛋白质与膜的结合。
*确保转膜缓冲液的SDS浓度合适（若加入了SDS），SDS浓度不要超过0.02–0.04%。过多的SDS会阻碍蛋白质与膜的结合。
*检查膜的孔径和靶标蛋白质的大小。小于10kDa的蛋白质很容易穿过0.45μm孔径的膜。如果您的目标蛋白质小于10 kDa，那么最好使用0.2μm孔径的膜。
*增加电压、电流或转印时间
*凝胶和SDS-蛋白质复合物中的SDS会促进蛋白质从凝胶中洗脱，但抑制蛋白质与膜的结合。这种抑制作用在硝化纤维素膜上的强度大于PVDF膜。对于难以从凝胶中洗脱的蛋白质，如大分子量蛋白质，可在转膜缓冲液中加入少量SDS以改善转印效果。我们建议在组装三明治前将凝胶置于含0.02–0.04% SDS的2x转膜缓冲液（无甲醇）中预平衡10分钟，然后使用含10%甲醇和0.01% SDS的1X转膜缓冲液进行转印。
*甲醇可去除SDS-蛋白质复合物中的SDS，促进蛋白质与膜的结合，但对凝胶本身有一些不良影响，会降低转印效率。甲醇可能导致孔径减小、某些蛋白质发生沉淀以及一些碱性蛋白质带正电荷或变为中性。应确保转膜缓冲液的甲醇浓度不高于10–20%，并使用高质量的分析级甲醇。
*确保每个泳道上标准品的量都是正确的。蛋白质上样过多会导致模糊，这个问题在使用银染凝胶时尤为突出。
*条带在低百分比凝胶中不能很好地分辨。尝试使用更高百分比的凝胶。
*如果在转膜/检测后条带看起来不明显和模糊，可能是由于抗体浓度过高。遵循制造商建议的稀释度或通过斑点印迹确定最适抗体浓度。
*凝胶上的分子量标准品的量不足： 将适当体积的分子量标准品上样到凝胶上。以下是我们的建议：(小型凝胶：每孔5μL（厚度0.75-1.0 mm）或每孔10μL（厚度1.5 mm）;•大凝胶：每孔10μL（厚度0.75-1.0 mm）或每孔20μL（厚度1.5 mm）)
*转印不全或不理想： 优化转印条件
*样品被煮沸： 丢弃煮沸的分装样品。
*使用的分子量标准品体积过大： 加入较少的体积或使用前用蛋白质上样缓冲液稀释分子量标准品。