实验方法原理    

实验材料    CB-MNCs
试剂、试剂盒    灭菌培养基过柱缓冲液FcR阻断剂CD34微球
仪器、耗材    柱子（MS+ RS+或LS+ VS+)磁珠细胞分离仪尼龙过滤网 30μm
实验步骤    
(a)准备过柱缓冲液，用抽真空装置去除气体。

(b)每108个CB-MNCs用终体积300μL缓冲液重悬。

(c)每108个CB-MNCs悬液加100μL FcR阻断剂，抑制CD34微珠非特异性结合或通过Fc受体介导与非靶细胞的结合。

(d)每108个CB-MNCs悬液加100μL CD34微球进行细胞标记，充分混匀后在6〜12℃冰箱放置30min。

(e)加PBSA洗，室温200g离心10min;加适量的缓冲液重选细胞。

(f)根据CB-MNCs的细胞总数选择合适的柱子类型（MS+/RS+或LS+/VS+)，将柱子放人MACs分离仪的磁场中。加人缓冲液润洗柱子（MS+/RS+:50μL;LS+/VS：3mL)。

(g)用30μm的尼龙过滤网过滤细胞，去除细胞团。使用前，用缓冲液湿润柱子。

(h)将细胞悬液加人柱子，使未结合的细胞通过柱子。

(i)用缓冲液将未结合的细胞洗去（MS+/RS+:3×500μL;LS+/VS:3×3mL)。

(j)洗脱结合的细胞。将柱子从分离仪中移出。置于合适的管中。将柱子加满缓冲液（MS+/RS+:1mL;LS+/VS: 5mL)。用柱子随带的内塞，加压将结合的细胞冲洗出来。

(k)加PBSA将CD34+细胞洗一遍，室温200g离心l0min。用适当的培养基重悬细胞。
体外扩增CD34+细胞
实验方法原理    ，
实验材料    CD34+细胞
试剂、试剂盒    ​灭菌培养基；*IMDM细胞因子（Flt-3配体干细胞因子促血小板生成素IL-6)
仪器、耗材    培养瓶
实验步骤    
(a)用添加细胞因子的培养基重悬细胞（50 ng/mL Flt-3配体，50 ng/mL干细胞因子，20 ng/mL促血小板生成素和10 ng/mL IL-6)。

(b)按2×104个细胞/mL的细胞浓度将CD34+细胞接种到T25培养瓶中。

(C)每周两次半量换液，补充细胞因子。
饲养层细胞共培养体外扩增CD34+细胞
验方法原理    
实验材料    CD34+细胞
试剂、试剂盒    ​灭菌MSCs培养基C100μg mL共培养的培养基细胞因子（干细胞因子IL-6Flt-3配体促血小板生成素）
仪器、耗材    6孔培养板
实验步骤    
(a)将脐带血来源的间充质干细胞（blood-derived mesenchymal stem cells, CB-MSCs)作为饲养层细胞，用MSCs培养基重悬CB-MSCs，细胞浓度为5×104个细胞/mL。

(b)将CB-MSCs接种到6孔板

(C)每周两次半量更换新鲜培养基。

(d)当CB-MSCs达到以上汇合时，用10μg/mLc处理,37℃ 2.5 h„

(e)用无血清IMDM将CB-MSCs洗两遍。

(f)按1×104个/mL CD34+细胞重悬于含细胞因子的共同培养基（100 ng/mL干细胞因子，100ng/mL IL-6,50 ng/mLFlt-3配体，10 ng/mL促血小板生成素）。

(g)将CD34+细胞接种到CB-MSCs饲养层细胞上。

(h)每周两次更换1/4培养基。

(i)2周后，收集未贴壁细胞