聚合酶链反应(PCR)技术是在体外进行的由引物介导的酶促DNA扩增反应。PCR反应的关键环节：①模板核酸的制备；②引物的质量与特异性；③酶的质量；④PCR条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析检测。

1、 模板
a．模板质量不佳，含有杂蛋白质，特别是染色体中的组蛋白；模板核酸变性不够；提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。建议选择质量可靠的提取试剂，重新提取高纯度基因组模板；若模板为cDNA，需要检查逆转录反应及其所用RNA的纯度及完整度。
b．模板中含有尿嘧啶抑制高保真酶的活性，或含有Taq酶抑制剂。
c．模板浓度过高，或含有一些buffer，抑制PCR扩增，如cDNA模板，建议稀释后再使用。
d．靶序列变异。如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，导致PCR不能有效扩增。

2、引物：引物的设计、引物质量是PCR扩增成败的关键。
a．引物设计不合理，如引物长度不够、引物之间形成二聚体等，需要重新设计引物。
b．合成高质量、高纯度级别的引物。
c．引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期4℃保存，导致引物降解失效。

3、  酶的质量：
a．酶失活，建议更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或活性降低而导致没有产物。
b．酶扩增效率低，建议更换扩增效率高的酶。

4、 PCR条件:
a．PCR扩增条件：变性对PCR扩增相当重要，如变性温度低、变性时间短都有可能出现扩增无产物；退火温度过低，可导致非特异性扩增而降低特异性扩增效率；退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。
b．Mg2+浓度：Mg2+浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高会降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败。
c．反应体系：反应体系配制错误，建议重复实验。通常进行PCR预实验采用的是小体系，正式实验如需扩大体系时，一定要重新摸索条件，否则容易出现扩增效果不理想或者失败。

操作步骤:
准备好各种试剂和PCR仪，就可以开始PCR实验：将各种试剂混合并按照说明书设置PCR反应。一般PCR循环如下：

1. 起始步骤：这对于热启动PCR而言是必须的，将反应混合液加热至94-98度以激活DNA聚合酶。这一步的时间取决于所选用的DNA聚合酶。
2. 变性步骤：DNA本身是双链结构，而DNA扩增需要引物与单链DNA模板相结合。在这一步，反应混合液被加热至94-98度保持20-30秒以破坏双链间的氢键以便释放出单链DNA。这是PCR循环中的第一步。
3. 退火步骤：变性之后，DNA模板以单链的形式在反应混合液中存在。因为反应体系中的引物与DNA模板互补，当反应温度降至50-65度时，引物与互补的序列形成氢键。退火温度主要取决于引物的Tm值，通常比引物Tm值低3-5度。这一步通常维持20-40秒，而聚合酶会结合至引物-模板双链处开始DNA合成。
4. 延伸步骤：在这一步，DNA聚合酶开始DNA合成，因此这一步的温度选取的是DNA聚合酶的 优温度。通常我们选用72度，但某些DNA聚合酶的最适温度是68度。这一步与体内的DNA复制很相似：DNA聚合酶按照碱基互补规律将dNTPs加到引物的3’末端最终得到新的DNA双链片段。延伸时间取决于目的DNA片段的长度和DNA聚合酶的合成能力。一般而言DNA聚合酶每60秒能够合成1kb长度的DNA。
5. 第2步至第4步称为一个循环：每次循环之后DNA的量均是前一次的两倍。通常一次PCR反应进行30-35个循环。在前几轮的PCR循环过程中PCR产物的量以指数速率增长，但是到了反应后期随着dNTPs和引物的量的减少以及DNA聚合酶的失活，反应速率逐渐下降，因此PCR反应的产量也受到了限制。
6. 最后的延伸步骤：当30-35个循环结束后，我们通常会以68-74度延伸5-10分钟，这是希望使反应体系中残留的单链DNA全部反应完毕。
7. 维持时间：通常我们设置4-10度为反应后PCR产物的保存温度。