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PCR反应条件及循环阐述

时间:2024-12-09      阅读:38

        PCR反应在生物体外大量扩增特定DNA片段的分子生物学技术,其特点是可以以微量的DNA为模板,快速扩增得到大量拷贝。

一、PCR反应条件的控制:

1.  PCR反应的缓冲液提供合适的酸碱度与某些离子 。 

2.  镁离子浓度 总量应比dNTPs的浓度高,常用1.5 mmol/L。
  
3.  底物浓度dNTP以等摩尔浓度配制,20~200 umol/L。
 
4.  TaqDNA聚合酶2.5U(100 ul)。
  
5.  引物 浓度一般为0.1 ~0.5 umol/L。
 
6.  反应温度
(1)变性温度和时间95℃,30 s。
(2)退火温度和时间 低于引物Tm值5 ℃左右,一般在45~55℃。
(3)延伸温度和时间72℃,1 min/kb(10 kb内)。
(4)Tm值=4(G+C) +2(A+T)
7.  循环次数 :一般为25 ~30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低,可增加循环数以便达到有效的 扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右,循环数超过30个以后,DNA聚合酶活性逐渐达到饱和,产物的量不再随循环数的增加而增加,出现了所谓的“平台期”。

二、PCR的循环参数:
 
1.  预变性(Initial denaturation)

模板DNA全变性与PCR酶的全激活对PCR能否成功至关重要,建议加热时间参考试剂说明书,一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。

2.  循环中的变性步骤

循环中一般95℃,30秒足以使各种靶DNA序列全变性,可能的情况下可 缩短该步骤时间,变性时间过长损害酶活性,过短靶序列变性不全,易造成扩增失败。

3.  引物退火(Primer annealing)

退火温度需要从多方面去决定,一般根据引物的Tm值为参考,根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。

退火温度对PCR的特异性有较大影响。

4.  引物延伸

引物延伸一般在72℃进行(Taq酶最适温度)。但在扩增长度较短且退火温度较高时,本步骤可省略

延伸时间随扩增片段长短而定,一般推荐在1000 bp以上,含Pfu及其衍生物的衍生设定为1 min/kbp。

5.  循环数

大多数PCR含25-40循环,过多易产生非特异扩增。

6.  最后延伸

在最后一个循环后,反应在72℃维持5-15分钟.使引物延伸全,并使单链产物退火成双链。

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