实时荧光定量PCR：

2019-nCoV科研ORF1ab-N片段质粒实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：
1）Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性*，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。
外标准曲线的定量方法相比内标法是一种准确的、值得信赖的科学方法。利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确，重现性的定量方法，已得到全世界的*，广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。定量PCR除可以对样品的初始浓度进行准确定量外，还有其它多种丰富的应用。还包括基因表达调控情况的分析、等位基因的分析等。

探针荧光定量PCR试剂盒原理分析如下图：

荧光定量PCR服务：
简介：实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前该技术已被广泛用于检测细胞mRNA表达量的变化；比较不同组织的mRNA表达差异；验证基因芯片，siRNA干扰的实验结果等。我公司为您提供全套实时荧光定量PCR技术服务，全部实验皆使用进口试剂完成，主要定量PCR仪器。
1、荧光定量PCR服务要求：
（01）请您提供新鲜的且尽量多的材料；或直接提供纯化好的总RNA（大于 5 ug/样品）；或直接提供纯化好的DNA（大于 5 ug/样品）。
（02）请提供已知的全长基因序列。
（03）请提供尽可能详细的背景资料：DNA/RNA 来源等
2、荧光定量PCR操作程序
（01）引物（探针）设计与合成。
（02）提取DNA/RNA，样本逆转录成cDNA。
（03）进行Real Time PCR实验，进行实验结果分析。
（04）实验完成后，提供完整的实验报告（含软件分析结果）及引物等实验材料。
3、荧光定量PCR的收费标准：
  我公司根据客户的样品数量进行不同的收费标准。
以下产品是公司正在*产品：
 

苄星邻氯青标准品HEPES sodium salt N-(2-羟基)哌-N-磺酸钠盐  Amresco

氯唑西林钠标准品HEPES sodium salt N-(2-羟基)哌-N-磺酸钠盐  Amresco

氯氮平标准品Lovastatin 洛伐他汀

氯氮平分离度用混合物标准品Lovastatin 洛伐他汀

古柯标准品Disodium hydrogen phosphate 磷酸氢二钠  USP

可待N-氧化物标准品CHAPS

维生素A、D标准品CHAPS

秋水仙素标准品CHAPS

盐酸考来替泊标准品β-Cydodextrin β-环糊精

多粘菌素E磺酸钠标准品β-Cydodextrin β-环糊精 SIGMA尼泊金酯标准品聚烯亚胺 分子量7000（50%水溶液）

基香兰素标准品聚烯亚胺BR，99%，分子量2-3万，液体

双醋炔诺醇标准品聚烯亚胺BR，99%，分子量2-3万，液体

依替膦酸钠标准品Carbomer 卡波姆940

依替膦酸钠相关物质A标准品Polyethylene-polypropylene glycol 407 泊洛沙姆407

羟基叉二膦酸标准品（HEDP）Polyethylene-polypropylene glycol188 泊洛沙姆188

*度酸标准品Polyethylene-polypropylene glycol 407 泊洛沙姆407

非洛地平相关物质A标准品Polyethylene-polypropylene glycol188 泊洛沙姆188

苯硫咪唑标准品PVP40000 聚烯吡咯烷酮，Amresco

苯硫咪唑相关物质A标准品PVP40000 聚烯吡咯烷酮，Amresco

荧光化学物质：
实时荧光定量PCR所使用的荧光物质可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下：
1. TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成*同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的技术平台。
2. SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加*同步。SYBR仅与双链DNA进行结合，因此可以通过溶解曲线，确定PCR反应是否特异。
3. 分子信标：是一种在5和3末端自身形成一个8个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，导致荧光基团与淬灭基团紧紧靠近，不会产生荧光。PCR产物生成后，退火过程中，分子信标中间部分与特定DNA序列配对，荧光基因与淬灭基因分离产生荧光 。