节 免疫组化操作步骤及抗原修复（供参考）

一、免疫组化操作步骤
（一）、仪器设备
1、 18 cm 不锈钢高压锅或电炉或用微波炉
2、 水浴锅
（二）、试 剂
1、 PBS 缓冲液（pH7.2―7.4） 吉试剂
2、 0.01mol/L 柠檬酸钠缓冲液（CB,pH6.0,1000 ml）
3、 3% 甲醇―H2O2 溶液：用 30% H2O2 和 80% 甲醇溶液配制
4、 风裱剂：
a. 甘油和 0.5 mmol/L 碳酸盐缓冲液（pH9.0–9.5）等量混合
b. 油和 TBS（PBS）配制
5、 TBS/PBS pH9.0–9.5，适用于荧光纤维镜标本；pH7.0-7.4 适合光学纤维标本
（三）、操作流程
1、 脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置 60 分钟或 60℃ 恒温箱中烘烤 20 分钟
a. 组织芯片置于二甲苯中浸泡 10 分钟，更换二甲苯后在浸泡 10 分钟
b. 无水乙醇中浸泡五分钟
c. 95% 乙醇中浸泡五分钟
d. 75% 乙醇中浸泡五分钟
2、 抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片
二、抗原修复（免疫组化石蜡切片）
用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片需要抗原修复。
福尔马林固定的组织有可能破坏了原来组织的抗原结构，蛋白多肽发生交联，导致部分抗原表位封闭，结合位点减少，所以需要抗原修复，以暴露原来的抗原表位，达到充分显露抗原，以不出现明显脱片现象为佳。
抗原修复的几种常用方法（供参考）
1、 微波炉加热：
在微波炉里加热 0.01 枸橼酸钠缓冲液（pH6.0）沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔 5-10 分钟，反复 1-2 次。根据玻片情况可参考采用微波加热「3-5-3 法」3 分钟温火沸腾后静止 5 分钟，再温火沸腾 3 分钟即可。
适用的抗原：来源于人、大鼠、小鼠的组织标本；来源于其他动物种属的组织标本。
2、 沸热修复：
电炉或水浴锅加热 0.01M 枸橼酸钠缓冲液（pH6.0） 95℃ 左右，放入组织芯片加热 10-15 分钟。
3、 高压热修复：
在沸水中加入 EDTA（pH8.0）或 0.01m 枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）. 盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10 分钟后除去热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。（骨及软骨组织的标本选择较温和的微波加热修复）。
4、 酶消化方法：
常用 0.1% 胰蛋白酶和 0.4% 胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热 37℃，消化时间约为 5-30 分钟。
适用于被固定遮蔽的抗原：包括 Collagen.GFAP. Complement.Cytokeratin.c-erB-2.LCA.LN. 等。
三、石蜡切片免疫组化染色步骤
1、三步法（以 SP 试剂盒为例）
 石蜡切片脱蜡水
 蒸馏水冲洗，PBS 浸泡 5 分钟，如果采用抗原修复，可在此步后进行
- 3% H2O2 室温孵育 5~10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS 冲洗，2 分钟×3 次
- 5~10% 正常山羊血清封闭，室温孵育 10 分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃ 孵育 1~2 小时或 4℃ 过夜
-PBS 冲洗，2 分钟×3 次
滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS 稀释），37℃ 孵育 10~30 分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃ 或室温孵育 10~20 分钟
 PBS 冲洗，2 分钟×3 次
滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS 稀释），37℃ 孵育 10~30 分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃ 或室温孵育 10~20 分钟
 PBS 冲洗，2 分钟×3 次
显色剂显色（DAB 或 AEC）--（DA1010 DAB 显色试剂盒（20×））吉试剂
自来水充分冲洗，复染，脱水透明、封片
如果必要，可选用 avdin 封闭内源性生物素
2.SABC 法
脱蜡、水化
PBS 洗 2 次各 5 分钟
用蒸馏水或 PBS 配制新鲜的 3% H2O2 ，室温封闭 5-10 分钟，用蒸馏水洗 3 次
抗原修复
PBS 洗 5 分钟
滴加正常山羊血清封闭液，室温 20 分钟，甩去多余液体
滴加Ι抗 50ul, 室温静置 1 小时或 4℃ 过夜或 37℃1 小时
PBS 洗 3 次各 2 分钟
滴加生物素化Ⅱ抗，20℃-37℃ 20 分钟
PBS 洗 3 次各 2 分钟
滴加试剂 SABC 20℃-30℃ 20 分钟
PBS 洗 4 次各 5 分钟
DAB 显色：试剂盒或自配显色剂显色
脱水、透明、封片、镜检
四、冰冻切片的免疫组化染色步骤
速冻组织
冰冻切片 4~8μm，冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存于-20℃ 冰箱
室温放置 30 分钟后，入 4℃ 丙酮固定 10 分钟，也可根据需要选择其他的固定方式
PBS 冲洗，5 分钟×3 次
用 3% 过氧化氢孵育 5~10 分钟，消除内源性过氧化物酶的活性
PBS 冲洗，5 分钟×3 次
下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤（滴加一抗开始）
第二节 免疫组化抗原热修复的技术要点（供参考）
一、抗原热修复温度和时间的关系
我们日常工作中所使用的组织固定液福尔马林会引起组织蛋白内或蛋白之间的亚甲基发生桥连，具体过程如下：
步：基本反应福尔马林和氢反应形成新的化合物；
第二步：基本反应福尔马林和氢反应形成新的亚甲基桥。
上述反应的结果导致许多抗原决定簇被封闭，而加热可以水解该桥连使抗原被激活。影响抗原热修复的两个关键的因素是温度和时间，有人将这两种因素对抗原修复的影响总结为下面的公式： 抗原热修复的有效性=加热温度（T）× 加热时间（t）。
也就是说当我们修复时的温度越低则需要修复的时间就越长；反过来当修复温度增高时修复的时间可以适当地缩短，才能使抗原决定簇*暴露，这种反比的关系从 MBI 单克隆抗体的实验结果「表 1」中也可以清楚地看出。

如果修复强度不够，免疫组织化学染色所显示的只能是修复后暴露的部分抗原决定簇，而不是组织所含的全部抗原。这样的染色结果可能会非常弱，或出现假阴性，即使是阳性结果，充其量只能起到定性的作用，不能适应今后对免疫组化进行定量的需要。这就给我们诊断中定量指标的应用带来困难，例如用来测定耐药的指标。
二、组织固定时间和所需的抗原热修复的关系
大量的实验表明，固定时间越长的标本，它所形成的桥连就越紧密，抗原就越难以被激活，所需要的修复强度也就越强。有意思的是随着固定时间的延长，组织中蛋白对温度的耐受也相应增高，这可能就是我们对固定时间长的标本加大修复强度的理论基础。
这就提醒我们在做回顾性的研究时一定要注意所使用的修复条件，它与新鲜标本的修复条件一定是有所区别的，同等条件下一定要加长修复的时间或提高修复所使用的温度，才可能得到比较满意的结果。
三、不同 pH 值抗原修复液对染色结果的影响
抗原热修复中所使用的修复液 pH 值也会对染色结果产生相当大的影响。
pH 值对染色结果的影响大概可以分为以下四种情况：
A. 稳定型，pH 值对染色结果影响不大，如 PCNA、AE1、EMA、CD20 等；
B.V 型，高 pH 值和低 pH 值染色较好，而 pH 值 4-5 染色结果较差，如 ER、Ki-67 等；
C. 上升型，随着 pH 值的增加，染色结果逐渐增强，如 HMB45 等；
D. 下降型，随着 pH 值的增加染色结果逐渐减弱，当然这种类型的抗体只是个别的现象，如 MOC31。
一个有趣的现象值得注意，即在高 pH 值都有较好的染色结果，所以目前比较推崇的抗原修复液为高 pH 值得修复液，如 1 mM EDTA, pH8.0 或 pH9.0 等。但是由于传统习惯，绝大多数医院和实验室都在使用 pH6.0 的枸橼酸缓冲液。综合以上各种抗体的染色状况，考虑到临床工作的实际情况，许多国外免疫组化专家建议，在常规的免疫组化工作中，全部选用高 pH 值得修复液来代替目前广为使用的 pH6.0 枸橼酸缓冲液。为此，本公司已经推出 pH8.0 和 pH9.0 的新型抗原修复液。经验证，绝大多数的抗体使用 pH9.0 得修复液效果都要优于 pH6.0 的枸橼酸，尤其是核阳性的抗体。所以，在常规的免疫组化工作中，使用高 pH 值的抗原修复液是今后的必然趋势。