透射电镜常用的50-100 kV电子束来说，样品的厚度控制在10～100 nm为宜。由于电镜产生的电子束穿透能力很弱，需要把标本切成厚度小于0.1 µm以下的薄片才适用，这种薄片称为超薄切片(Ultrathin sectioning)。常用的超薄切片厚度是50-70 nm，也可进行冷冻超薄切片。

超薄切片技术是为透射电子显微镜观察提供薄样品的专门技术，研究材料类、生物类样品的基本技术，尤其是观察细胞、组织、器官等的超微结构以及亚细胞结构常用的技术。也是电镜细胞化学、免疫电镜等技术的关键性技术。它在生物学的发展过程中占据重要的地位，目前各种细胞、组织的超微结构知识几乎都是由它提供的。

冷冻超薄切片机 Leica EM UC7

取材→固定→脱水→包埋（渗透、包埋、聚合）→超薄切片→电子染色（生物类）

取材→清洗→包埋（渗透、包埋、聚合）→超薄切片→电子染色（材料类）

生物样品超薄切片要求：

（2）切片厚度50-100 nm为宜：太薄反差低；太厚反差好，但结构重叠，电子束不能穿透；

（3）切片应耐电子束的强烈照射，不变形不升华；

（4）切片能够适当被染色，保证一定的反差；

（5）切片均匀，无皱褶、刀痕，无染色剂或其他化学物质的沉淀。

目地和要求

（1）新鲜。(材料离体后1-5 min内进入固定液，避免细胞自溶和结构变化)

（2）体积小。(厚度<1 mm，长度宽度均<5 mm，固定液渗透能力有限，组织太大会导致无法固定充分）

（3）机械损伤小。(动作轻巧，器械锋利，避免对组织的挤压和推拉，建议用剃须刀片、手术刀片、手术剪刀。)

（4）低温操作，器械、容器、固定液均需预冷（降低酶的活性，减少组织自溶）。

（5）取材部位准确，且注意材料的方向性和定位。

目的和要求：终止组织细胞的生化过程同时把它们的超微结构改变控制在最小范围内，并保护这些结构在后续的脱水、包埋等过程中不被破坏；将蛋白、离子等内容物保留在原位，以便后续的研究。

（1）破坏细胞的酶活性系统

（2）稳定细胞物质成分，并保存之

（3）接近细胞生活状态的渗透压,使细胞不收缩或膨胀

（4）在组分的分子之间建立交联，提供骨架稳定细胞器的空间构型

（5）提供一定的电子反差

戊二醛（C5H8O2)：渗透性好，保存蛋白质、酶活性，稳定糖元，无电子染色作用，固定脂类和膜差。可长时固定（低温可达半年）。

锇酸（OsO4)：强氧化剂，固定脂类、膜结构，有电子染色作用；破坏酶活性。

多聚甲醛：优良地保存酶活性，用于细胞化学。

缓冲液：仿效细胞外液成分，对细胞富有生理保护。维持稳定的pH值；提供适当的渗透压；提供适当的离子成分使样品不抽提，不沉淀。

    1.pH值：动物组织7.2-7.4，植物6.8-7.0，高度含水组织8.0-8.4

    2.缓冲液类型：磷酸缓冲液、缓冲液等，0.05-0.1 mol/L

    3.渗透压：KCl, NaCl, 蔗糖调节

    4.固定剂浓度：戊二醛2-6%等

    5.材料大小：0.5-1 mm³

操作步骤：

戊二醛固定液：有细胞壁的样品5%，无细胞壁样品3%。加入缓冲体系，确保生物样本内外渗透压，避免细胞缩小或吸涨。

30％→50％→70％→80％→90％→95％(以上步骤每次15-20 min)→100％(2-3次，每次15 min)→100％丙酮(20 min) 

常用Epon 812、Spurr、LR white等

可手工、机械修块。

醋酸铀：主要染核酸、核蛋白、细胞核、结缔组织。要避光，有微弱的放射性

柠檬酸铅：主要染膜结构、脂类、核酸。易与CO2反应成沉淀，染色中应避免。

步骤：单染：铅盐单染,铀盐单染。