循环肿瘤DNA（ctDNA）液体活检是非常活跃的研究领域，且已证明其是微创癌症检测和监测的有力手段。在个性化疾病监测中，细胞游离DNA（cfDNA）的表观遗传状态也正成为一种有前景的生物标志物，也可能被证明在癌症筛查中具有价值¹。纳米孔测序技术能准确灵敏地检出低丰度的cfDNA和ctDNA^2,3，且可直接从纳米孔测序数据中检测DNA甲基化，而无需在样本制备过程中进行相关转化或扩增。因此此技术平台未来有望成为“液体活检的强大工具”^4,5。

此前，意大利佛罗伦萨癌症研究和预防机构ISPRO的Martignano团队，创新地采用Oxford Nanopore纳米孔低深度全基因组测序（WGS）从癌症液体活检样本中检测拷贝数畸变（CNA），并发表了相关论文³。在此基础上，该团队又与以色列耶路撒冷希伯来大学的Katsman团队开展合作。最近他们证明，液体活检中cfDNA和ctDNA的Oxford Nanopore纳米孔低深度全基因组测序（WGS）技术还可用于检测cfDNA的细胞起源、癌症相关片段标记物和癌症特异性甲基化特征，并且其结果与短读长测序得到的数据集相当⁵。Katsman团队总结了该平台的优点：[Oxford Nanopore Technologies]研发的测序技术操作简单，一次测序就可获得多种特征，测序仪成本低且便携，因而在临床研究领域很有价值⁵。

利用纳米孔测序检测甲基化非常吸引Katsman及其团队，因为亚硫酸氢盐WGS法存在样本可能显著降解和输入材料损失，并可能难以确定片段规律等缺点。此外，亚硫酸氢盐测序无法区分5mC和其他修饰，如5hmC、5fC和5CaC，而这些修饰原则上均可通过纳米孔技术检测到⁵。

Katsman团队仅基于cfDNA分析，使用纳米孔测序并与对应的短读长WGS数据集进行比较，估计了其样本中癌细胞的比例。为更好理解低测序深度影响，该团队进行了降采样实验，并且证明了当纳米孔WGS数据降采样至0.2x平均覆盖深度时，结果仍然一致。当以更高的深度对短读长文库进行测序时（中位数为1.3x），Oxford Nanopore的纳米孔测序得到的肿瘤比例估计值与短读长测序的结果极为相似。

他们还证明，Oxford Nanopore纳米孔低深度全基因组测序（WGS）技术就可再现正常非癌细胞类型的构成，而使用短读长亚硫酸氢盐法（WGBS）则需要更高的测序深度才能做到。

此外，Katsman团队发现，肿瘤比例更高的样本，其片段大小也往往更短，因此，片段长度差异也可能用于区分癌症类型⁵。采用Oxford Nanopore的测序技术，可对短片段进行高效测序，同时也可比短读长测序法更能捕获到较长的cfDNA片段（如Yu等人⁶最近的报告）。

Katsman团队指出，虽然样本规模小，但他们获得的结果显示，在DNA甲基化、片段化和CAN的癌症特异性特征方面，纳米孔测序数据与短读长WGS和WGBS数据集之间大体一致。降采样分析显示，纳米孔测序所需的基因组覆盖度（至少0.2x），足以根据DNA甲基化特征检测出所有样本中癌症衍生的DNA。

作者们还指出，他们其他相关工作表明，纳米孔测序样本制备快，测序快，可在1-3小时内就对肿瘤DNA以甲基化为基础进行分类⁵。虽然他们没有在自己的研究中测试过这种快速测序方法，但希伯来大学的高级研究员Ben Berman认为，这是他们研究基于纳米孔技术的液体活检的最终目标之一，即“在诊疗现场几小时内完成全面分析”⁷。

cf DNA测序：起始样品<1 ng，无需PCR

尽管cfDNA分析领域发展迅速，但每毫升血浆只能提取单纳克或更少的cfDNA仍然构成一大瓶颈，因为测序通常需要数百纳克的DNA。为解决这一难题，Lau及其同事们开发了一种无需PCR和亚硫酸氢盐的Oxford Nanopore纳米孔测序方法，以有效表征cfDNA的甲基化特征⁸。具体而言，该团队开发了一系列操作步骤，将样本条形码和纳米孔测序接头有效地融入cfDNA，并系统地优化反应条件，以最大限度地提高cfDNA文库产量。

“用这种无PCR方法，只需从每份样本提取纳克量或更少的cfDNA就可生成测序文库⁸”

用他们的方法，每份cfDNA样本可生成多达数亿读长，比现有方法提高了一个数量级。例如，用5 ng DNA可获得约600万个已比对和过滤的读长，用100 pg DNA可获得约140,000个比对读长。

他们将其方法用于表征癌症研究样本的cfDNA甲基化组，并证明了在治疗中使用这些特征进行纵向监测的潜力（图1）。获得的甲基化特征揭示了特异性治疗反应和耐药性转移癌的出现。

作者们在讨论他们对本研究的长期愿景时得出结论：“这种方法有可能对癌症检测和表征的液体活检诊断产生影响”⁸。

图1：结直肠癌研究样本中cfDNA的纵向甲基化特征。总cfDNA读长（上图）和与对应肿瘤匹配的甲基化特征读长（下图）。第400天后，具有肿瘤特异性甲基化变化的读长片段比例显著增加，这与肿瘤转移进展相关。（图来自Lau等人，2022年⁸）

“这项可行性研究表明，Oxford Nanopore低深度WGS技术可成为液体活检的有力工具⁵”

参考文献

1. Klein, EA. et al. Ann Oncol. 32:1167–77 (2021)

2. Marcozzi, A. et al. NPJ Genom Med. 6, 106 (2021)

3. Martignano, F. et al. Molecular Cancer. 20:32 (2021)

4. Yuen, ZW-S. et al. Nat Commun. 12:3438 (2021)

5. Katsman, E. et al. Genome Biology. 23:158 (2022)

6. Yu, SCY. et al. Proc Natl Acad Sci USA. 118. (2021)

7. Berman, B. Personal communication with Oxford Nanopore Technologies on 23 August 2022

8. Lau, BT. et al. bioRxiv. 497080 (2022)

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