DiD，DiO，DiI，DiR 和 DiS 细胞膜染料的使用方法

DiD（CAS：127274-91-3），DiO（CAS：34215-57-1），DiI（CAS：41085-99-8），DiR（CAS：100068-60-8）和DiS染料是一族亲脂性的荧光染料，可以用来染细胞膜和其它脂溶性生物结构。当与细胞膜结合后其荧光强度大大增强，这类染料有着很高的淬灭常数和激发态寿命。一旦对细胞染色，这类染料在整个细胞膜上扩散，浓度时可以使整个细胞膜染色。它们的荧光颜色区分明显：DiI（橙色荧光），DiO（绿色荧光），DiD（红色荧光）和 DiR （深红色荧光）这使得他们可以用来对活细胞进行多色成像和流式分析。DiI和DiO可以分别用标准的 FITC和TRITC的滤光片。DiD可以用 633 nm He–Ne 激光器激发，有着比DiI更长的激发波长和发射波长，在细胞和组织染色中更有价值。 DiR的红外荧光可以穿透细胞和组织，在活体成像中用来示踪。

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其它相关产品：

DiO   CAS：34215-57-1

DiI   CAS：41085-99-8

DiD   CAS：127274-91-3

DiR   CAS：100068-60-8

使用方法：

1. DiD，DiO，DiI，DiR和DiS细胞膜染色液制备

（1）配置DMSO或EtOH 储存液：储存液用 DMSO或EtOH配置浓度1～5 mM。

注意：未使用的储存液保存在-20°C，避免反复冻融。

（2）工作液制备：用合适的缓冲液（如：无血清培养基，HBSS或PBS）稀释储存液，配制浓度为1～5 µM的工作液。

注意：工作液的终浓度是根据不同细胞和实验的经验来配制。可以从推荐浓度的十倍以上寻找较佳条件。 

2. 悬浮细胞染色

（1）悬浮细胞密度为 1 × 106/mL加入到工作液中。

（2）在37 ℃培养细胞 2～20分钟，不同的细胞较佳培养时间不同。

（3）染色细胞试管在1000～1500转离心5分钟。

（4）倾倒上清液，再次缓慢加入预温37℃的培养液。

（5）重复（3），（4）步骤两次以上。

3. 粘壁细胞的染色

（1）使粘壁的细胞在无菌实验室培养。

（2）从培养基中移走盖玻片，吸走过量培养液，将盖玻片放在潮湿的环境中。

（3）在盖玻片的一角加入100μL的染料工作液，轻轻晃动使染料均匀覆盖所有细胞。

（4）在37 ℃培养细胞 2～20分钟，不同的细胞较佳培养时间不同。

（5）吸干染料工作液，用培养液洗盖玻片2～3次，每次用预温的培养基覆盖所有细胞，培养5～10分钟，然后吸干培养基。

4. 显微镜检测

（1）DiD，DiO，DiI，DiR和DiS滤光器的选择参见表1。

（2）多色染料的同时检测，滤光器按照以下设定：

a) DiI和DiO＝Omega XF52，Chroma 51004；

b) DiI和DiD＝Omega XF92，Chroma 51007；

c) DiI，DiO和DiD＝Omega XF93，Chroma 61005

5. 流式细胞仪的检测

DiD，DiO，DiI，DiR和DiS 染色的细胞可以分别用经典的FL1，FL2，FL3和FL4流式细胞仪检测。

 储存条件：-20℃干燥避光保存，有效期一年。