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避免RNA降解的注意事项

1. 使用正确的细胞或组织储存条件 

在样品用液氮瞬间冻结之后，应该储存在-80°C，千万不能解冻。即使是置于含有胍盐的裂解液中作匀浆前的短暂解冻，也会导致 RNA 的降解和损失。瞬间冻结的组织应该首先在超低温条件下先研磨成粉，然后置于裂解液中进行匀浆。RNAfixer 使样品储存更为便利。储存在 RNAfixer 中的细胞或组织可在室温下稳定保存长达 1 个星期，在 4°C 可稳定保存长达1 个月，或**保存在-20°C。 

2. 消除环境 RNase 的污染 

为了得到完整的、高品质 RNA，在整个 RNA 制备过程中，当 RNA 离开强蛋白变性剂（如离液裂解液或酚）的保护时，避免引入新的 RNase 污染就非常关键。由于 RNase 几乎是**，所以必须确保与纯化的 RNA 接触的每一样东西都是无 RNase 污染的。所有的表面，包括移液器、工作台、玻璃器皿和制胶设备，都必须用表面去污净化溶液如 RNase 喷雾清除剂来处理过，去除各种溶液或者反应缓冲液中可能存在的 RNase 污染，可以用 RNAsafe。必须保证一直使用无 RNase 的枪头、试管和溶液，手套也应经常更换。 

3. 迅速灭活内源的 RNA 酶，以防止 RNA 降解 

以下 3 个方法均可有效使内源 RNA 酶失活： 

1）用含离液（如胍盐）的细胞裂解液收获样品，并立即匀浆。 

2）用液氮瞬间冻结样品。值得特别注意的是：组织块必须保证足够小，在浸入液氮的瞬间

就能冻结，以确保瞬间令 RNA 酶失活。 

3）立即将样品置于 RNAfixer 无液氮 RNA 样品储存液中。它是一种水相、无毒的收集试剂，

能立即稳定并保护完整、未冻结的组织和细胞样品中的 RNA。关键要点是组织样品切片一定要够薄（<0.5 cm），这样 RNAfixer 才能在 RNase 破坏 RNA 之前迅速渗入组织块中。                                               

4.选择合适破壁方法 

细胞或组织的*匀浆对 RNA 提取来说，是一个很关键的步骤，它能够防止 RNA 的损失和降解。匀浆的方法应根据细胞或组织的类型来选择。大部分培养的细胞可以置于细胞裂解液中，通过简单的涡旋震荡来匀浆；而动物组织、植物组织、酵母和细菌、真菌则常常需要更加剧烈的方法，通常用液氮研磨。比如说细菌（特别是革兰氏阳性菌）的细胞壁，就需要溶菌酶消化来实现*的细胞裂解和 RNA 的最大回收，酵母提取时加入破壁酶帮助破壁。 

5.选择最适 RNA 提取试剂（盒） 

现有众多的 RNA 分离方法也许令人难以取舍。目前**也是**的方法是柱式分离，也就是结合基于 Trizol 原理的裂解液和硅胶膜吸附柱的使用，是目前比较通用的一种方法。

对于动物细胞，组织，植物叶片等常用材料都基本适用。植物 RNA 的提取比较难抉择，像根和果实等，由于多糖，多酚物质的存在，很难纯化；还有就是血清等液体样本的提取，水分多或者 RNA 含量少等，较难提取。可以采用针对性的试剂（盒） 

6. 低浓度 RNA 的沉淀 

纯化得到的 RNA 可能需要通过沉淀来浓缩，以满足一些下游应用的需要。醋酸铵(NH4OAc) 沉淀（加 0.1 体积的 5M  醋酸铵、2-2.5 体积的无水乙醇，-20°C 放置 25 分钟以上）可以很好地回收RNA。如果需要定量回收低浓度的RNA（ng/ml），可以采用共沉淀（如  linear acrylamide 糖原 glycogen,酵母 yeast  RNA）的方法。核酸助沉剂是 linear  acrylamide，当RNA 用于 RT-PCR 分析时，线性的丙烯酰胺和 DNase 处理的糖原都可以作为理想的共沉淀剂，因为它们都不含 DNA 污染，糖原含量高会抑制 PCR 反应，应注意控制浓度，核酸助沉剂对 PCR 无影响，成为病毒核酸提取的**。酵母 RNA 和未处理的糖原会给样品带来核酸污染，有可能影响 RT-PCR 的结果。沉淀后，注意避免 RNA 沉淀过分干燥，因为这可能导致很难重新溶解。 

7.提取好的 RNA 如何储存 

RNA 最好是提取完成后，立刻进行下游实验。如果只是短期储存，重悬的 RNA 应放置于-20°C；如果是长期储存的话，就应该放置于-80°C。储存 RNA 时，可以加入少量的 RNA酶抑制剂防止 RNA 的降解。 

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