凝胶层析分离的一般原理和操作方法

一、目的要求：

1. 学习与掌握亲和层析和凝胶层析分离的一般原理和操作方法。

2. 了解自动化纯化设备基本组成和原理。

3. 了解亲和吸附层析琼脂糖、凝胶过滤葡聚糖的基本性质。掌握组氨酸标签蛋白的基本性质和纯化原理和操作；掌握缓冲液置换和脱盐的原理和操作。

二、实验概述（如右图）

实验步骤：

1. 样品预处理：即通过超声这种细胞破碎的手段，将在大肠杆菌E.coli中表达的重组的带6个His标签的绿色荧光蛋白释放到相应的缓冲液当中，再通过离心，0.2微米滤膜过滤等去除细胞碎片和别的污染物；

2. 组氨酸标签蛋白亲和层析：HisTrapTMHP crude, 1mL预装层析柱，进行亲和层析，一步就可以达到90%左右的纯度

3. 凝胶过滤层析脱盐去除咪唑：HiTrapTM  Desalting 5mL预装层析柱进行脱盐，置换缓冲液

4. 电泳：对纯化过的样品的检测。

三、设备以及试剂准备（试剂均使用化学纯以上）：

1. 仪器：核酸蛋白检测仪HD系列、自动部分收集器BSZ\DBS系列、恒流泵HL系列

2. 样品：EGFP原液

3. 层析柱：HisTrap HP 1ml, 1根；HiTrap Desalting 5ml，1根

4. 层析缓冲液

5. 注射器，烧杯，负压脱气瓶等实验室常用容器

四、实验内容

1. 仪器和实验准备：

所有缓冲液需要过0.2um膜过滤，负压脱气抽滤瓶脱气，脱气装置如图所示

样品预处理：即通过超声这种细胞破碎的手段，将在大肠杆菌E.coli中表达的重组的带6个His标签的绿色荧光蛋白释放到相应的缓冲液当中，再通过离心，0.45 微米滤膜过滤等去除细胞碎片和别的污染物；用注射器吸取大于2ml样品

将注射器内的样品从样品环3号口推入，注意不要将气泡推入样品环(如右图)。