饲料中黄曲霉毒素B1检测方法

一、使用单位需自备的设备及试剂

（1）仪器

微孔板酶标仪(450 nm/630 nm)

氮气吹干装置

振荡器

离心机

涡旋仪

粉碎机

电子天平（感量0.01 g）

（2）器材

单道微量移液器：20 μL～200 μL，100 μL~1000 μL

多道微量移液器：30 μL～300 μL

（3）试剂

黄曲霉毒素B1试剂盒。

二、溶液的配制

样本前处理需配制：

配液1：样品稀释液：将浓缩样品稀释液用去离子水按1:9 体积比进行稀释（1 份浓缩样品稀释液+9 份去离子水）。

配液2：洗涤工作液：将浓缩洗涤液用去离子水按1:9 体积比进行稀释（1 份浓缩洗涤液+9 份去离子水）。

配液3：样品提取液：用去离子水将甲醇按3 : 2 体积比进行稀释（3 份甲醇+2 份去离子水）用于提取样本中的黄曲霉毒素。

三、样本前处理方法

样本处理前须知：

处理任何样本时，都须注意：

（1）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。

（2）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必须使用洁净实验器具，以避免污染干扰实验结果。

样本前处理步骤：

（A）谷物（大米、玉米、小米等低脂含量）及配合饲料

1. 取5 g 粉碎样品，加入25 mL 样品提取液；

2. 充分振荡混匀5-10 min；

3. 4000 r/min 离心5 min，或用定量分析滤纸过滤；

4. 取0.2 mL 离心后的上清液或过滤后的滤液加入到1 mL 样

品稀释液中进行稀释并充分混匀；

5. 取50 μL 稀释后的样品待测。

稀释倍数：30

（B）花生、花生饼等油脂高的饲料

1. 取5 g 粉碎的样品，加入20 mL 石油醚或正己烷和25 mL样品提取液；

2. 充分振荡混匀5-10 min；

3. 离心或静置分层后去除上层液体；

4. 取0.2 mL 下层液体加入到1 mL 样品稀释液中进行稀释并充分混匀；

5. 取50 μL 稀释后样品待测。

四、酶联免疫检测步骤

测定前须知：

1、使用之前将所有试剂和需用微孔板回升至室温。

2、使用之后立即将所有试剂放回2~8 ℃。

3、在使用中不要让微孔干燥。

4、在ELISA 分析中的重复性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA 测定程序中的要点。

5、在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜盖住微孔板。

测定步骤：

1、将所需试剂和微孔板从冷藏环境中取出，在室温下平衡30 min，每种液体使用前均须摇匀。注意标准液均需做2个平行试验。

2、加标准品：加标准品/样本50 L 到对应的微孔中，再加入酶标记物50 L/孔，然后再加入50 L/孔抗体工作液，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温避光反应30 min。

3、洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加洗涤液250μL/孔，每次浸泡15~30 s，充分洗涤4~5 次，用吸水纸拍干。

4、显色：加入底物液A 液50 μL/孔，再加底物液B 液50 μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境反应15 min。

5、测定：每孔各加50 μL 终止液，设定酶标仪在450 nm 处，测定OD 值（建议用450/630 nm 双波长检测，在5 min内读完数据）。