如何快速构建稳定细胞株？

如何在实验流程上筛出高效表达的单克隆，

缩短筛选周期？

又将如何评估单克隆的稳定性？

以 Gibco ExpiCHO 培养基系统筛选稳转细胞株为例，小编为大家简述单克隆的筛选流程：

Gibco 培养基、补料、添加剂等，可用于常规哺乳动物细胞或昆虫细胞的培养

1.准备载体

通过内切酶进行载体线性化处理，利用核酸提取系统和纯化试剂盒进行质粒DNA提纯。

赛默飞 KingFisher Flex 基于磁珠分离的高通量核酸提取设备

2.转染细胞

转染前利用细胞计数仪确保细胞密度控制在2*106-6*106cells/mL，细胞活力在95–99%之间。

将ExpiFectamine CHO转染系统与质粒DNA室温孵育1-5min后转移到摇瓶培养系统。37℃ 8% CO2孵育两天后测定细胞活力，细胞个数以及抗体滴度 (理想情况高于4 mg/L)。

Nalgene一次性PETG无菌摇瓶

3.筛选

以5*105cells/mL的细胞密度，在30 mL ExpiCHO表达培养基中传代培养。摇瓶中加入G418或Puromycin等相应选择压力。培养第7天进行细胞计数，每3-5天传代一次。细胞密度达到1*106 viable cells/mL，细胞活力超过85%时，阶段一结束，并进行细胞冻存。从阶段一获取的细胞，将选择压力调整为阶段一的2-5倍进行再次筛选。

4.混合细胞株生产力的评估

从阶段二获取的细胞，以5*105cells/mL的细胞密度，在125mL摇瓶中培养。分别在第0，3，5，7，10，12和14天 (建议把第零天放到周五) 取样检测细胞密度，活力和抗体滴度。

5.获取单克隆

将混合细胞株按照如下稀释比例稀释至1000 cells/mL，利用分液器以0.5 cell/孔的密度接种至96孔板中，静置培养。

混合细胞株的层级稀释比例

赛默飞Combi nL自动分液器

分液体积50纳升至50微升

6.单克隆的放大培养以及筛选评估

将筛选出的单克隆从96孔板依次放大至125 mL摇瓶中培养。并进行层级筛选。

初始筛选：6孔板培养5天后，评估细胞蛋白表达，从中选取表达量较高的15-40个克隆转移至125 mL 摇瓶中；并进行细胞液氮冻存。

二级筛选：14天简单补料添加评估，分别在0，3，5，7，10，12和14天取样检测细胞密度，活力和抗体滴度；并在第3，5，7天补加葡萄糖培养。并进行细胞液氮冻存。

三级筛选：14天补料添加评估，细胞复苏传代2-5次后，3-14天检测细胞培养密度、活力以及蛋白表达。每个克隆均需要有1-3个平行对照。

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度纯度和糖谱分析，单样品分析耗时可小于40s

7.细胞株稳定性的评估

接下来需要评估获取的单克隆可以在多长的周期稳定表达蛋白。挑选16个单克隆，在摇瓶中传代60次或者连续培养12周评估单克隆的稳定性。