细胞冻存是又是最复杂的生物学实验，简单是因为初入门的生物学小白也懂得如何冻存细胞；而复杂是因为，一个细胞冻存方案，是个国际性难题——如何优化冷冻保护剂(Cryoprotectant CPA),如何科学优化冻存曲线，保证一个好的复苏活率，这是个仰之弥高，钻之弥坚的问题。

低温生物学领域最著名的，莫过于Mazur双因素假说——水冰相变

根据Mazur两因素假说，细胞在冻存过程中，如果降温太慢，就会发生不可逆的损伤性脱水，例如线粒体和内质网在结构上受损。如果冷却太快，细胞没有足够的时间来达到最佳脱水状态，剩余的细胞内水会形成冰，这也是有害的，会损害细胞器的结构。

Applications and optimization of cryopreservation technologies to cellular therapeutics

Mazur双因素假说符合多年来实际观察到的结果。这就是经常被引用的“-1℃/min冷却速率”的起源 “-1℃”并不是一个神秘的数字，而是反映了在低温保存过程中，细胞达到最佳脱水状态所需的时间。这是在冷却细胞时生物质本身的安全冷却动力学，而不仅仅是冷冻设备的控制参数。

冲击冷却，诱导冰核产生

当液体冷却时，只有当温度降至溶液的平衡冰点以下时才能发生成核，在冰成核过程中，液体分子相互碰撞、聚集并形成团簇。这是一个随机发生的过程。通过在低温冷却器中快速冷却约2分钟，引入简短的“冲击冷却”步骤，也可以诱导冰核产生。冰成核是相变的一部分，冰晶的形成是一种放热相变，向环境释放热量，使样品瞬间升温。此时需要引入一个保持时间（大约10分钟，取决于样本），以允许冷却控制的潜热消散。

Walking on thin ice: controlled freezing & thawing of pharmaceutical active molecules

冻存保护剂的影响

Kymriah和Yescarta (FDA批准的前两种CART细胞药物)分别使用7.5%和5%的DMSO进行低温保存，在冷冻保存溶液中添加类似的糖和/或大分子。二甲基亚砜(DMSO)，被认为是“金标准”冷冻保护剂(CPA)，用于冷冻保存几乎所有有治疗意义的细胞(红细胞除外)。DMSO在长期暴露和输注期间具有高度的细胞毒性，可在高达50%的患者中引起轻微不良反应，以及更罕见但更严重的心血管、神经或呼吸问题。

一些CPA(如二甲基亚砜或甘油)会穿过细胞膜并提供细胞内保护，而其他一些制剂，如糖或聚合物，虽然细胞内渗透很少，依然可以在细胞系统中提供CPA效应，这归因于它们产生部分脱水和限制细胞内有害冰晶的形成。

这是一个“经验法则”，几乎所有有核的哺乳动物细胞在冷冻保存期间都需要细胞内保护;非渗透性CPA可以为调节细胞外环境中的冰晶生长(从而有助于减轻冰形成的渗透效应)。大分子聚合物，不进入细胞，直接保护细胞膜，诱导在细胞外形成玻璃化的溶液。

Applications and optimization of cryopreservation technologies to cellular therapeutics

不同的包材类型对程序性降温过程的显著影响

Development of a Reliable, Low-cost, Controlled Cooling Rate Instrument for the Cryopreservation of Hematopoietic Stem Cells

一套稳定成熟的程序降温方式，可以有效维持细胞活性，满足细胞高质量冻存需求，保证细胞冻存环节的安全性，合规性。一台安全可靠的程序性降温仪，是至关重要的一个环节。它可以提供冲击冷却，控制冰核生成，保证一度每分钟的降温速率，均一化标准化地冷冻大批量的样本。

程序性降温主要是通过微处理器控制系统和电磁阀，通过控制喷入腔体中的液氮量来精确控制降温速率。其优点是：控温精确，受外界环境影响小。尤其是处理大体积样本时，快速喷入的大量液氮更易带走样本中的潜热，从而快速降温，保证更好的样本复苏活性。

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