人原代肝细胞(Primary human hepatocytes, PHH)一直被视为毒理学领域中先进的体外人体肝脏模型系统。然而，传统的转染方法对这些细胞的转染性研究一直具有挑战性。且随着培养过程的展开，PHH往往会快速失去其典型的肝功能，这限制了进一步研究的深入。Lonza带来的新研究旨在优化冷冻保存的PHH的解冻、转染和培养程序，以期能够持续保持其稳定性和肝细胞功能。研究中对转染7天后的肝脏细胞进行了转染效率和肝细胞功能的综合分析，以分析这一优化过程的成效。

那么就让我们来看看具体用到了哪些设备与程序，以及这7天的报告[1]吧!

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设备

· 4D Nucleofector™ Core unit(Catalog# AAF-1003B, Lonza)

· 4D Nucleofector™ X unit(Catalog# AAF-1003X, Lonza)

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试剂

· Cryopreserved Primary Human Hepatocytes(Catalog# HUCPI, Lonza)

· Hepatocyte culture media: HCM Bullet Kit(Catalog# CC-3198, Lonza)

· P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X Kit L(Catalog# V4XP-3024, Lonza)

· Matrigel(Corning)

· Cleancap mCherry RNA(TriLink)

· CellTiter-Blue Cell Viability Assay(Promega)

· Human Albumin ELISA Kit(Bethyl)

· Cholyl-lysyl-flurescein(CLF) staining(Corning)

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结果

使用EX-147程序，观察到高达68%的DNA转染效率。白蛋白分泌和细胞色素p450活性在转染后24小时明显可检测到，但部分不能持续较长时间(数据未显示)。因此，我们推荐EX147程序用于高效的短期DNA转染。

使用DS-150程序，DNA的效率高达20%，mRNA的效率高达85%，并持续7天。转染后24h细胞活力和白蛋白分泌略有下降，但随着时间的推移逐渐恢复。与对照培养相比，CYP1A2、CYP2B6和CYP3A4活性在60%至80%之间。转染的PHH形成复杂的、分支的胆管网络。我们推荐DS-150程序，用于siRNA和mRNA的高效转染，以及转染后长期培养的中等水平DNA转染。

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结论

我们提出了在冷冻保存的PHH中高效表达DNA和mRNA的研究方案。通过Lonza的研究表明，使用DS-150方案后，转染肝细胞的功能可高度保存7天。这一方案有助于使转染人肝细胞能够产生更复杂的长期体外肝脏模型。