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有了它生物制品的核酸残留控制不是问题

时间：2024-01-25 阅读：90

随着越来越多的生物制品进入治疗领域，该类制品的质量控制也日趋严格，其中核酸残留一项是各类质控标准的重中之重，因为DNA的稳定性，容易在生产过程中产生残留，而这些生物制品应用到人类疾病治疗时，会带来不可控危险因素。终产品的宿主核酸残留量必须遵循WHO、FDA和EMEA以及我国NMPA监管条例。尤其近年来包括进口产品在内的狂犬疫苗DNA残留超标问题，引起了社会和业界的广泛关注。

生产生物制品的宿主细胞多是连续传代细胞(continuouscelllines, CCLs)，其调控生长的基因失灵，而拥有无限增殖的能力，CCLs的残留DNA可能使人体细胞生长失控，变成肿瘤细胞。所以需要严格控制生物制品的残余DNA，避免这种风险危害。1984年的国际会议上采纳了残余DNA的临时标准，即来自CCLs的生物制品DNA残留不能超过10pg/人份剂量。1986年WHO的会议指出残余宿主DNA的主要风险与其潜在致瘤活性有关。

此外，残余DNA中可能存在感染性病毒基因组，病毒基因组能够扩增并产生感染性病毒粒子。体外实验表明，1pg逆转录病毒的前病毒DNA就具有感染性。有些残留DNA可能携带HIV病毒或者Ras致癌基因，DNA感染性风险可能比致瘤风险更高。

另外，有学者认为，接种几十针疫苗后，其残余的DNA累积可能具有其他潜在危害：未发生降解的外源DNA，在哺乳细胞基因LINE-1的逆转录转座子作用下有插入细胞基因组的可能性，带来其他潜在风险。

而且，由于微生物来源的基因组DNA富含CpG和非甲基化序列，增加了重组蛋白药物在体内的免疫原性风险，可能增加体内免疫反应，诱导产生DNA抗体。

因此从安全角度，在生物制品的生产工艺中必须有去除DNA的步骤，并进行检验验证。有研究采用病毒DNA定量感染的方法评价DNA的灭活程度，采用逐典全能核酸酶可消除其感染活性。WHO和各国药物监管机构一般控制100pg/每剂量的残留DNA，特殊情况下最高允许10ng/剂量。

我国部分疫苗及治疗用生物制品残留DNA标准

（中国药典2015）

来源	名称	细胞	DNA残留标准
进口疫苗	小儿麻痹疫苗	Vero	10pg 剂量-1
狂犬病疫苗	Vero	10ng odose-1
国产疫苗	肾综合征出血热疫苗	Vero	100pg 剂量-1
乙型脑炎疫苗	Vero	10pg 剂量-1
狂犬病疫苗	Vero	100pg 剂量-1
乙型肝炎疫苗	Vero	10pg 剂量-1
甲型肝炎灭活疫苗	Vero	100pg 剂量-1
治疗性生物制品	EPO、单克隆抗体等	CHO	100pg 剂量-1
干扰素、GM-CSF、白介素等	E.coli/Yeast	10pg 剂量-1

我国参照WHO、FDA和欧盟标准，很早就对生物制品中残余DNA含量进行限制。从卫生部颁布的《人用重组DNA制品质量控制要点》到近年的《中国生物制品规程》和药典，都对DNA残留做了严格要求，部分标准高于国际标准。美国药典2015版（USP38-NF33）中增加了新的章节（General Chapter<30>）来进一步规范残留DNA的检测方法和标准物质。新版USP中将推荐qPCR法作为生物制品中的宿主残留DNA检测方法。

此外，在CAR-T细胞治疗中，病毒包装后的核酸去除也是必要质量控制，必须保证回输的细胞足够纯，减低风险和危害。

除却生物制品中必须要去除核酸残留，在平常的蛋白提取、生化分析样品回收中，核酸残留的影响也是非常大的，有效去除核酸残留，可明显降低细胞裂解液粘度，提高蛋白得率，蛋白生化分析中也可提高分辨率，并提高回收率。

在核酸残留去除工作中，难点是由于DNA带有大量的电荷易与其他生物大分子结合从而产生聚集（吸附）、包裹作用而难以除去。传统的方法均存在低含量核酸残留去除不净、工作量大耗时长的致命缺陷，全能核酸酶可解决此类难点。

常用核酸去除方法

方法	作用	特点
离子交换层析	DNA带有大量的负电荷，可以被阴离子交换剂吸附而除去	负载量大、成本低廉，其缺点是在DNA残留要求较高的情况下难以达到。
鱼精蛋白沉淀	鱼精蛋白为碱性蛋白，带有大量的正电荷，能够与DNA结合生产沉淀，从而将DNA去除	操作简便、迅速，能有效降低DNA 残留量。其缺点在DNA残留要求较高的情况下难以达到；需要使用大量的鱼精蛋白，容易造成鱼精蛋白残留。
DNaseI	DNase Ⅰ具有DNA酶活性而不具有RNA酶活性，主要用于RNA去除DNA	用于重组蛋白等去除DNA活性偏低，效果不理想
全能核酸酶	能够降解各种形式DNA和RNA，对单链、双链、线状、环状和超螺旋形式的DNA和RNA的磷酸二酯键均具有很高的活性，产生5’-磷酸核苷酸或5’-磷酸寡核苷酸	高效去除核酸残留，且对核酸没有序列要求操作简便耗时短

逐典Pannarase全能核酸酶是一种来源于Serratia marcescens的非特异性核酸内切酶，该酶可以将任何形式的 DNA 和 RNA (线性、环形、超螺旋)降解成3-5bp的寡核苷酸，并可在一系列宽泛的操作条件下保持高效性。逐典全能核酸酶从E.coli中表达纯化并在GMP条件下生产，可高效去除各种样品中的核酸杂质，助力解决广大疫苗生产、基因和细胞治疗厂商解决产品的核酸残留问题；此外某些病毒生产中可能会涉及到高盐的环境，逐典Pannarase耐高盐全能核酸酶将成为您“疑难杂症”的选择！

全能核酸酶优势：

1.无动物源性、无氨苄青霉素

2.杰出单位比酶活、更高效的核酸降解能力

3.先进的生产工艺，非传统His标签纯化、排除引入金属离子风险

4.严格的质控标准，内毒水平低，确保单位酶活的准确性以及批次间稳定性

全能核酸酶应用条件：

全能核酸酶的酶活会受到多种因素的影响（例如温度、pH、离子强度等），故用量范围也会从0.1 U/mL-250 U/mL不等。因此，不同的操作环境下酶的最佳浓度不同，需要通过实验设置梯度进行最佳条件的摸索。

应用实例：

1.样品：狂犬病毒浓缩液

处理条件:核酸酶浓度50~90U/ml ,

37 ℃处理 2 h,转入18 ~ 26 ℃处理 6h