02/下篇

Knock-in

对于Knock-in，目前还存在一定的难度，大多数的出版物只能实现10-40%的敲入效率，不同位点也存在差异。Nature Biotechnology今年5月的一篇出版物利用SLEEK (SeLection by Essential-gene Exon Knock-in)技术可以在T细胞上实现超过90%的KI效率，同样在其他常用的免疫细胞如NK，B cell，IPSC等细胞都实现了非常高的KI效率。

对于常规的KI实验，我们依然可以从以下方面考量进行进一步优化：

Donor DNA用量的测试

▲ Theodore L Roth et al., 2018

▲ Zelda Odé et al., 2020

HA长度

HA的长度会影响KI的效率，但并不意味着越长越好。

▲ Zelda Odé et al., 2020

▲ Soyoung A. Oh et al., 2022

HA修饰

▲ Brian R. Shy et al., 2021

▲ Jonas Kath et al., 2022

特殊成分提高HDR效率的测试

也有文献结果表明PGA对KI的效率没有帮助，仅供参考。

▲ Ya-Wen Fu et al., 2021

▲ David N. Nguyen et al., 2020

选择dsDNA或ssDNA或AAV载体进行KI

dsDNA会随着用量的增加显著增加对细胞活率的影响。

▲ Theodore L Roth et al., 2018

HDR Enhancer

▲ Jonas Kath et al., 2022

甚至HDR, RNP, 细胞的混匀顺序也可能会对结果造成影响

▲ Theodore L Roth et al., 2018

电转前后培养体系

▲ Theodore L Roth et al., 2018

Nucleofection 条件优化

通常可以参考KO的条件进行KI实验，但依然可以依照具体的实验需求调整。

▲ Theodore L Roth et al., 2018

▲ Soyoung A. Oh et al., 2022

对于Knock-in，还可以通过其他手段提升结果，如PAM and Track mutations, 具体内容可以参考如Cas蛋白或sgRNA供应商。

通常KO不会对细胞的活率产生太大影响，但是对于KI，需要用到donor DNA，如dsDNA，或者使用更强的电转染条件，这些可能会导致活率的负面影响。