ALPHA（Amplified Luminescence Proximity Homogeneous Assay）是一种基于微珠的高灵敏度均相检测技术。与 HTRF 技术类似，ALPHA 技术适用于药物发现阶段的高通量筛选，属于免洗的免疫检测技术，已在国内外药物研发企业和科研院所中获得广泛认可。本文将简要介绍 ALPHA 技术的原理、技术特点、家族及主要应用、多重检测以及使用注意事项。

一、Alpha 基本原理

Alpha 技术使用供体和受体两种微珠。当结合于供体微珠上的分子 A 与结合于受体微珠上的分子 B 相互作用，且两个微珠距离足够接近（<200nm）时，能够检测出发光信号。供体微珠表面的光敏剂经 680nm 的激光照射后被激发，将周围的氧转变为单线态氧。单线态氧在溶液中扩散，遇到受体微珠后可在受体微珠内引发一系列级联放大的化学反应，并最终发射出光。若分子 A 与分子 B 不发生相互作用，则供体微珠产生的单线态氧不会到达受体微珠，从而不会引发化学发光反应。

二、Alpha 技术特点

均相检测：无需洗涤步骤，操作简便。

较宽检测范围：适合 nM 至 μM 范围的亲和力检测。

低背景、高灵敏度：可避免环境因素的自发荧光背景干扰。

更适合生物分子检测：有效距离可达 200nm。

更多检测因子：适合更多的因子检测。

可用于微量检测：样品用量可低至 5 微升。

易于自动化检测：适合 96、384 和 1536 微孔板规格。

多重检测：可用于多重因子同时检测。

与 ELISA 相比，AlphaLISA 在洗板、实验步骤、微孔板规格、自动化程度、实验通量、样品量、灵敏度、检测范围和性价比等方面具有明显优势，并且可以进行多重检测。

三、Alpha 家族及主要应用

Alpha 微珠类型

Alpha 微珠分为供体微珠（Donor Bead）和受体微珠（Acceptor Bead）。在 Alpha 技术中，供体微珠相同，经激光激发后可产生单线态氧分子。受体微珠根据发射波长不同分为四种类型：AlphaScreen（红荧烯，发射波长 520 - 620nm）、AlphaLISA（铕 Eu，发射波长 615 - 623nm）、AlphaPlex 545（铽 Tb，发射波长 515 - 555nm）和 AlphaPlex 645（钐 Sm，发射波长 645nm）。

AlphaScreen 和 AlphaLISA

AlphaScreen 是第一代 Alpha 技术，受体微珠发射波长为连续的 520 - 620nm 波段。

AlphaLISA 是升级后的技术，受体微珠发射波长非常窄，峰值在 615nm 附近，可避免很多干扰因素，降低假阳性和假阴性。目前，AlphaLISA 产品已替代 AlphaScreen 的大部分产品。AlphaLISA 技术主要应用于蛋白与蛋白相互作用（PPI）、激酶和表观遗传学研究的生化筛选、第二信使检测（GPCR）以及生物标志物检测（Cytokine、Biomarker）等领域。在细胞因子检测中，AlphaLISA 提供 Biotin-Free 版本的检测试剂盒，降低细胞培养环境中生物素对检测结果的干扰。AlphaLISA 还提供双重检测的试剂盒。

Alpha Surefire 和 Alpha Surefire Ultra

在研究信号通路的磷酸化蛋白检测中，需使用 Alpha Surefire 系列产品。Alpha Surefire Ultra 版本进行了两个更新设计：采用 CaptSure 技术替代早期版本的 Protein A 链接结构，提升抗体捕获的特异性；改用 AlphaLISA 受体微珠，具有更好的光谱特性。目前，AlphaLISA Surefire Ultra 技术主要用于信号分子的总蛋白和磷酸化蛋白检测。

四、Alpha 技术的多重检测

Alpha 技术提供三种发射波长的受体微珠，理论上可同时进行三种分子的检测，但考虑酶标仪配置因素，目前大多数情况下只能同时进行两种分子的检测。

AlphaLISA 的双重检测

Alpha 技术一般采用包被 Eu 的受体微珠，对于部分生物标志物的检测，也提供 Tb 包被的受体微珠检测试剂盒（AlphaPlex），可在一个微孔板孔内检测两种细胞因子。

Alpha Surefire Ultra 的双重检测

针对检测蛋白的种类不同，分为两种情况：

同一个靶点的总蛋白和磷酸化蛋白检测推荐使用 MPSU 版本（Alpha SureFire Ultra Multiplex），提供套装试剂盒，可同时检测总蛋白及特定磷酸化蛋白的含量变化。

不同靶点的磷酸化蛋白检测需分别购买两种 Surefire Ultra 试剂盒，即 Alpha Surefire Ultra kit（ALSU）和 Terbium SureFire Ultra kit（TBSU），可在一个孔内同时检测不同蛋白的磷酸化水平。目前，Alpha 提供 30 余种 TBSU 的检测试剂盒，可与 ALSU 搭配使用。特别提示，TBSU 试剂盒不能单独使用。

五、Alpha 技术使用注意事项

实验过程中部分步骤需避光，尽量保持恒温。

使用时，尽量按照说明书的操作步骤进行实验。

微珠试剂不要冷冻保存。

实验前请先确认酶标仪的功能和配置。