导读

药物免疫毒性可以定义为非预期的免疫抑制或免疫调节。免疫抑制可能导致宿主对传染源或肿瘤细胞的抵抗力下降，而免疫增强可能会加剧自身免疫性疾病或过敏反应。药物诱导的全身免疫激活可导致与细胞因子过度释放相关的严重反应，也称为细胞因子风暴。由于免疫系统的功能具有高度的物种特异性，因此很难通过动物研究来预测人类细胞因子的释放。全血检测在药物开中属于易于操作的体外解决方案。能快速简单地监测人类细胞因子释放，从而预测药物的功效和安全性。相比基于PBMC的测定更科学、更便捷，不需要纯化和分离细胞。少量血液（<5mL）足以测试多种实验条件。

研究内容

这项研究选择免疫途径和相关激动剂来靶向Toll样受体途径、STING途径或TCR激活途径。最后通过HTRF定量人IL1β、IL2、IL6、IL8、TNFα和IFNγ。此外，将HTRF数据与ELISA参考试剂盒获得的数据进行比较，以评估两种技术之间的相关性。

来自3位不同献血者的新鲜血液被收集在肝素管中，并且全血样品均质化后在RPMI中稀释。将化合物分配到96孔板中，然后添加预稀释的全血样品。在37°C下孵育过夜，收集上清液，按表1所示稀释全血上清液。最后使用HTRF或ELISA测量细胞因子。

实验结果

01 Toll样1、2、4、6受体的激活

用HKLM、LPS或酵母聚糖刺激Toll样受体途径。下图显示了未处理样品与处理样品中每种测量细胞因子的浓度。HTRF解决方案能够测定所有样品中的基础细胞因子水平（虚线）以及测量细胞因子分泌的增加。

02 STING通路的激活和T细胞受体途径的激活

2,3cGAMP是STING途径的特异性激活剂。激活后的细胞因子分泌谱显示TNFα、IL1β和IL6显着增加。相反，IFNα、IL2或IL8没有显着反应（下图）。图6显示OKT3/抗CD28刺激全血中的T细胞诱导轻微的IFNγ释放，但未能诱导任何IL2产生。然而，对照条件PHA或PMA/离子霉素诱导IL2和IFNγ细胞因子的强烈增加。这些数据表明OKT3/CD28并没有产生强烈T细胞特异性反应。

03 HTRF和ELISA检测之间的相关性

由于ELISA方法仍然是生物体液中细胞因子测量的传统常用方法，因此本研究将HTRF获得的细胞因子浓度与ELISA测定获得的细胞因子浓度进行比较。来自3个不同供体的全血样本首先在地塞米松存在/不存在的情况下用R848（TLR 7/8激活）进行刺激。通过HTRF或ELISA进行R848+/-地塞米松处理后IL8释放的测量，并确定两种化合物的EC50或IC50。下图显示了HTRF和ELISA人IL8测定之间在164个样品上获得的相关性。在这里，研究证明了两种检测之间具有非常好的相关性，相关值r=0.993，比例偏差为0.77。

然后研究比较了通过HTRF和ELISA在3个不同供体上获得的R848和地塞米松药理剂量反应（下图）。结果表明，两种方法测得的R848的EC50值或地塞米松的IC50值也非常接近（见表2）。

随着免疫肿瘤学或代谢疾病等领域的研究和药物发现的快速发展，监测免疫系统对治疗的反应比以往任何时候都更加重要。全血检测是一种用于评估对治疗免疫反应简单而强大的体外工具。HTRF细胞因子检测具有免洗方案、低样品消耗和广泛的动态范围，与ELISA相比，可以增加测试化合物的数量，并快速获得全血中细胞因子分泌的数据，为在生理环境中测试化合物创造了理想的方法平台。