前言：使用液相色谱/三重四极杆质谱仪对蛋白质进行常规的高通量定量分析时，我 们将多肽作为相应蛋白质的替代物。选择*的多肽以及适合每种目标多肽的 MRM 离子对是分析成功的关键步骤。考虑到仪器质量数范围限制，分析时通常 不会选择具有高 m/z 母离子或子离子的多肽。但是，若要解决生物学问题，此 类多肽也许能提供关键信息，甚至可能是唯yi的分析选择。此类例子包括具有 大型疏水性跨膜结构域的膜蛋白、带有多种翻译后修饰结构的蛋白质，以及内 源性多肽等等。 本应用简报将介绍 Agilent 6495B 三重四极杆质谱仪分析具有高 m/z 子离子的多 肽的性能，并展示将分析的质量数范围扩展至 m/z 3000 带来的优势。将胰蛋白 酶消解的单克隆抗体 (mAb) 标准品和 HeLa 细胞膜富集提取物分别作为简单样品 和复杂样品进行分析。

实验方法 蛋白质/多肽选择 使用 Agilent 6550 Q-TOF 质谱仪，在数 据依赖型模式下采集抗 IL8 mAb 消解 物和 HeLa 细胞膜富集蛋白质消解物 的 LC/MS 数据。使用 Agilent Spectrum Mill（B.05.00.181 SP1 版）比对适用的 数据库检索原始数据，鉴定出产生高 m/z 子离子的多肽，以此测试 Agilent 6495B 三重四极杆质谱仪的性能。

LC/MS/MS 系统 将 Agilent 1290 Infinity UHPLC系统连 接至质量数范围达 3000 u 的 6495B 三 重四极杆质谱仪。LC/MS 实验采用 安捷伦喷射流 (AJS) 离子源和 Agilent Poroshell 120 EC-C18, 2.1 × 100 mm 2.7 µm 色谱柱（部件号 695775-902）进行。 使用 3.5 分钟的 MRM 方法分析 mAb 消 解物，HeLa 细胞膜消解物则使用 21 分 钟的 MRM 方法分析。

制备 mAb 消解物的稀释系列，并将每 个进样浓度的信号响应相对于 mAb 消 解物的总柱上进样量作图，据此进行 糖肽定量分析。 此外，通过将每种子离子的信号响应 相对于对应的柱上进样量作图，执行 HeLa 细胞膜多肽的定量分析。

结果与讨论：多肽鉴定和选择 采用抗 IL8 mAb 消解物和 HeLa 细胞膜 消解物开发多肽鉴定和 MRM 方法， 所得结果如下： 选择来自 mAb 消解物的一种 G1F N-糖 肽和来自 HeLa 细胞膜消解物的三种 多肽（子离子质量数范围为 m/z 204.1 至 m/z 2429.3）进行 LC/MS/MS 测试 （表 2）。

图 1 和 图 2 显示了其中两种多肽的 MS/MS 谱图和优化的 MRM 色谱图。 MS/MS 图中用 * 标记出了为 MRM 方 法选择的子离子。 糖肽会产生具有大型多糖链的高 m/z 子离子，这些子离子能够为多糖的结 构解析提供丰富信息。

在复杂样品中，具有较高 m/z 的子离子 往往背景噪音更低或者信噪比更高。