摘要：监测生物药物的电荷异质性对于生产安全有效的药物至关重要，因为电荷分 布的改变可能会引起不良免疫反应。本应用简报展示了对利妥昔单抗创新药 物及其生物仿制药的电荷异构体的分析。电荷异构体在峰型模式方面表现 出相似性，但是创新药物与生物仿制药的单峰的强度则存在明显差异。从 Agilent 1260 Infinity 生物惰性液相色谱仪转换为 Agilent 1260 Infinity II 生物惰 性液相色谱仪，所获得的分析结果相当。结果还表明保留时间具有优异的一 致性，最大偏差小于 0.5%。两种系统在保留时间和峰面积方面获得了高精 度的结果。

前言：仪器间的方法转移对不同行业的实验 室而言都是一项重要课题1 。对于制药 及生物制药行业中经验证的方法，由 于实验室现代化的发展等因素，必须 实现从一台仪器到另一台仪器的等效 方法转换。 随着生物制药行业的发展，出现了 许多昂贵的新兴单克隆抗体 (mAb) 药 物，这导致了低价生物仿制药的不断 开发。对创新药物与生物仿制药的比 较研究对于评估生物仿制药 mAb 的安 全性和有效性至关重要。这些广泛的 研究包括重要的质量属性，例如滴度 分析、聚集研究、电荷异构体和糖基 化分析、肽谱分析等。两种最重要的 质量属性是聚集研究以及电荷异构体 分布的分析²。本应用简报中使用的 mAb 为利妥昔单抗的创新药物及生物 仿制药，此类药物与多药化疗法一起 用于治疗弥漫大 B 细胞淋巴瘤³。 本应用简报使用弱阳离子交换色谱法 (WCX) 分析了利妥昔单抗创新药物及 生物仿制药的电荷异构体分布情况。 对两种不同的生物惰性系统（Agilent 1260 Infinity 生物惰性液相色谱仪和 Agilent 1260 Infinity II 生物惰性液相色谱仪）进行比较以证明所测试的两种 系统的等效性。

实验部分：仪器 本实验在 Agilent 1260 Infinity 生物惰性液相色谱系统和 Agilent 1260 Infinity II 生物惰性液相色谱系统上完成。该系 统包括以下模块： Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液 相色谱系统 • Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元 泵 (G5611A) • Agilent 1260 Infinity 高性能生物惰 性自动进样器 (G5667A) • Agilent 1290 Infinity 柱温箱 (G1330B)，用于样品冷却 • Agilent 1290 Infinity 柱温箱 (G1316C)，配备生物惰性溶剂热 交换器 • Agilent 1260 Infinity 二极管阵列检 测器 (G1315C)，配备 10 mm 生物 惰性标准流通池 Agilent 1260 Infinity II 生物惰性四元 液相色谱系统 • Agilent 1260 Infinity II 生物惰性泵 (G5654A) • Agilent 1260 Infinity II 生物惰性 Multisampler (G5668A)，配备样品 冷却装置（选件 #100） • Agilent 1260 Infinity II 高容量恒温 箱 (G7116A)，配备生物惰性热交 换器（选件 #019） • Agilent 1260 Infinity II 二极管阵列 检测器 WR (G7115A)，配备生物 惰性流通池（选件 #028）

色谱柱 Agilent Bio mAb，非多孔，2.1 × 250 mm， 5 µm HPLC 色谱柱，PEEK（部件号 5190-2411） 软件 • Agilent OpenLAB CDS 2.1 版 • 安捷伦缓冲液顾问软件 A.01.01 [009] 使用 Agilent OpenLAB CDS 2.1 版软件 进行液相色谱仪控制和液相色谱数据 分析。OpenLAB CDS 2.1 版软件提供了 用于液相色谱、气相色谱和单四极杆 质谱的单个软件系统。它具有直观的 用户界面，以及可采用拖放式模板创 建的定制化交互式报告功能。 样品 利妥昔单抗创新药物和生物仿制药样 品购自印度当地的药店。 化学品 所有试剂均为液相色谱级。新制超 纯水产自配置 0.22 μm 膜式终端过滤 器 (Millipak) 的 Milli-Q Integral 水纯化 系统。磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和氯 化钠购自 Sigma-Aldrich 公司 (St. Louis, USA)。

 结果与讨论： 离子交换色谱的方法开发通常从 pH 筛选开始，通过 pH 筛选找到分离电 荷异构体的最佳色谱条件。在分离利 妥昔单抗电荷异构体的过程中，选择 磷酸盐缓冲梯度，使用氯化钠实现离 子强度的线性提升。能够使磷酸盐缓 冲液实现最佳缓冲容量的 pH 范围处 于 6 至 7.5 pH 之间。因此，pH 筛选 从 pH 6.2 开始，并以 0.2 的增量逐渐 提高至 pH 7.2。图 1 显示了使用利妥 昔单抗生物仿制药得到的 pH 筛选色 谱图。根据所调节的 pH 不同，观察 到保留时间以及分离度方面存在明显 差异。利用安捷伦缓冲液顾问软件计 算四元梯度，对所有调节的 pH 值采 用相同的四种储备液。结合由缓冲液 顾问软件计算得到的动态混合四元梯 度，可缩短并简化 pH 筛选工作流程4 。 特别是，与人工配制用于预混合的双 组分梯度的缓冲液相比，使用缓冲液 顾问软件计算得到的动态混合梯度能 够显著减少缓冲液配制时间。此外， 它可以避免中断分析序列以引入并冲 洗新的缓冲液组分，选择 pH 6.8 以实 现最高的分离度，并用于所有后续的 分析。