摘要 本研究中开发出了一种用于血浆中去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺定量的灵敏度高、 特异性好的 LC/MS/MS 分析方法。采用 Agilent Captiva NDLipids 过滤产品和选择性固 相萃取流程对血浆进行净化。此分析方法可达到所需的实用灵敏度，同时还能对相当宽 动态范围内的分析物进行定量分析。所有化合物均表现出出色的重现性 (CV < 5%)，且 所有校准曲线都获得了线性 (R2 > 0.9997)。

前言 本研究开发出的高效样品前处理流程适用于 同时提取血浆中的去甲肾上腺素、肾上腺素 和多巴胺（图 1）。将不同浓度的各种分析物 加入洁净血浆中可制得校准物。液相色谱/ 三重四极杆质谱仪 (LC/MS/MS) 非常适用于 像上述多种分析物的快速分析。色谱系统采 用 Agilent Pursuit 五氟苯基 (PFP) 色谱柱以 及甲醇与 1 mM 氟化铵水溶液组成的流动相。 研究中对定量 MRM 离子对进行监测，并加 入了每种分析物的氘代内标以确保定量分析 的准确性与重现性。

实验部分：液相色谱方法 液相色谱系统由 Agilent 1290 Infinity 液相色谱二元泵、配备恒温箱的孔板进样器以及 柱温箱组成。如果使用的液相色谱系统具有 不同的延迟体积，则可能需要调节并验证梯 度以重现出相同的色谱分析结果。 质谱方法 安捷伦 MS/MS 系统由采用安捷伦喷射流 技术的 Agilent 6460 三重四极杆质谱仪和 Agilent MassHunter 软件 B.07.00 组成。

化学品与试剂 校准物购自 Cerilliant (Round Rock, TX)、剑 桥同位素实验室 (Tewksbury, MA) 以及 Medical Isotopes 公司 (Pelham, NH)。DC Mass Spect Gold 血浆 MSG3000 购自 Golden West Biologicals (Temecula, CA)。 血浆内分泌激素对照品 0010 和 0020 购自 ChromSystems。Burdick & Jackson LC/MS 级甲醇和试剂购自 VWR 和 Sigma-Aldrich。 将 5.75 g NH4H2PO4 溶解于 500 mL 水中， 并用 30% 的 NH4OH 将其 pH 调节为 10，以 制得 pH 为 10 的 100 mM NH4H2PO4 缓冲液。 样品前处理 校准物 (Cerilliant) 由洁净的血浆基质 (Golden West Biologicals) 制得。采用同位素标记的 内标 (Cerilliant) 并对其浓度进行调节，使其 响应处于所需校准曲线范围的中部。实验采 用 ChromSystems 血浆对照品。重要信息： 在样品分析之前，血浆应冷冻保存于 –80 °C 下。采用含 0.5 M EDTA 和 317 mg/mL 焦亚硫酸钠的稳定剂

数据分析 Agilent MassHunter 定量数据分析软件 (B0.07.00) 用于进行数据分析。在校准曲线 的线性回归中采用 1/x 作为加权因子。在 MassHunter 定量软件中，利用色谱峰面积 与已知浓度内标的峰面积之比进行定量。

结果与讨论 通过 PFP 色谱柱实现了所有分析物的色谱分 离（图 2）。在每次运行结束时进行额外的 清洗以获得重现性。尽管未采用此方 法并进行测定，但肾上腺素与去甲变肾上腺 素之间的分离以及以及变肾上腺素与 3-甲氧 酪胺之间的分离尤为关键，因为这些化合物 产生相同碎片。如果不根据保留时间进行适 当分离，这些化合物将相互干扰，导致不准 确的定量结果。图 3 显示了这些化合物的分 离结果。 为研究 SPE 萃取流程的基质效应和回收率， 实验中配制并分析了 A、B、C 三组溶液。 这些混合物中包含 9 个不同浓度的全部三种 分析物及其内标。将溶液 A 加标至 0.2% 甲 酸水溶液中，并进样分析。对溶液 B 中的洁 净血浆进行萃取后对其进行加标（萃取后）。 对溶液 C 中的洁净血浆进行加标后对其进行 萃取（萃取前）。

基质效应和回收率的计算公式如下： 基质效应% = B/A × 100 回收率% = C/B × 100 A = 净标准溶液 B = 萃取后加标的血浆（萃取后） C = 加标后萃取的血浆（萃取前） 三种被分析物的基质效应介于 42% - 119% 之间，而回收率介于 56% - 59% 之间（表 2）。 因此，虽然在结果观察到了基质效应，但通 过内标补偿后仍获得了可接受的回收率，如 表 3 和表 4 所示。 连续三天对校准标样进行萃取，以确定日间 精密度和准确度。全部三种分析物均得到了 可接受的准确度，且线性范围内所有浓度的 变异系数均小于 5%（表 3）。分别于连续 三天以及一天中三次对 ChromSystems 对 照品进行萃取以确定日间和日内的变异系数， 所得到的变异系数均小于 4%（表 4）。该方 法在浓度为 5 - 2500 pg/mL 的测定范围内具 有出色的线性，R2 值均大于 0.9997（图 4）。

结论 本研究中开发出了一种用于血浆中肾上腺素、 去甲肾上腺素和多巴胺的稳定定量分析方法。 利用 Agilent Captiva NDLipids 过滤和固相 萃取产品同时提取出全部三种分析物，并 获得了良好的回收率。研究中还开发出与 LC/MS/MS 条件兼容的分析物的色谱分离 方法。