补肾填髓方对阿尔茨海默病模型大鼠学习记忆
能力及线粒体氧化应激的影响

目的观察补肾填髓方对阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD)模型大鼠学习记忆能力及线粒体氧化应激的影响。 方法50只大鼠先用Y迷宫初筛，再按旷场实验得分随机分成正常组、模型组、假手术组、中药组、西药组。假手术组两侧侧脑室注 射P淀粉样蛋白（AP)424,佘下除正常组外均以双侧侧脑室注射(AP)1^复制AD模型。造模后中药组灌服补肾填髓方，西药组灌服 多奈哌齐，其他组灌服等容量生理盐水，连续干预28 d。Morris水迷宫检测大鼠学习记忆能力，酶联免疫吸附方法(ELISA)检测大鼠 脑皮质及血清超氧化物歧化酶（superoxide dismufase, SOD)活性，硫代巴比妥酸法(TBA)检测大鼠脑皮质及血清丙二醛(malondi- aldehyde, MDA)活性，透射电镜观测海马线粒体超微结构。结果与模型组比较，中药组和西药组大鼠水迷宫逃避潜伏期缩短，在原 平台象限游泳时间及距离的百分比增加，差异均有显著统计学意义(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较，中药组SOD活性升高，MAD 活性减低(P<0.05，P<0.01);西药组的SOD活性升高，MDA活性降低(P<0.01);中药组及西药组的海马线粒体超微结构病理损害改 善。结论补肾填髓方可以改善AD大鼠的学习记忆能力，其机制可能与改善线粒体氧化应激有关。

〔关键词〕阿尔茨海默病；补肾填髓方；氧化应激；线粒体

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD)是与 年龄相关的中枢神经系统退行性疾病，以进行性记 忆下降及认知损伤为特点^[1]。由于人口老龄化，目前 世界范围内AD患病人数已经达到4 400万^[2]，给社 会带来沉重负担。AD的病因和发病机制复杂且并 不*清楚，现在的治疗药物不能*临床需 要，并且费用昂贵，还存在肝毒性、腹泻、恶心呕吐、 头晕等不良反应^[3]。因此，研究疗效更确切、副作用 更少的AD治疗药物非常紧迫。近年来，大量文献研 究报道，AD与氧化应激联系紧密，改善氧化应激可 以明显改善AD^[4-6]。补肾填髓方是根据中医学理论 “肾虚髓亏”，基于经典方剂孔圣枕中丹（《千金方》） 化裁而成，相关研究证实补肾填髓方药能有效延缓 痴呆早期患者大脑结构的萎缩，改善其认知及记忆 功能'但其作用机制并不十分明确。本研究拟以 AD模型大鼠为实验对象，从线粒体的氧化应激角 度，探讨补肾填髓方抗AD的作用机制。

1材料与仪器

1.1实验动物

90只健康雄性清洁级SD大鼠，体质量(180±20)g， 购自斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号:SYXK (湘）2010-0013;实验动物来源证号：430047000，饲 养于湖南省人民医院动物实验室。所有动物饲养在 室温22~25丈、湿度40%~60%条件下，以普通饲料 喂养，自由进食饮水。将大鼠观察性饲养1周后进行 Y迷宫实验初筛。

1.2实验药物、试剂及仪器设备

补肾填髓方由石菖蒲10 g，远志10 g，何首乌 15 g，yin羊藿15 g，龟板20 g，龙骨20 g组成。盐酸 多奈哌齐片，卫材药业有限公司，批号：1611013。 Ap_W2，Sigma 公司，批号：A4559。A^42-1，Sigma 公司，

批号:A2201(以无菌双蒸水将Ap_M2及AP42-1配制成 浓度为2 pg/pL,置于37 t恒温箱孵育7 d，保存于 4 °C 冰箱备用)。丙二醒(malondialdehyde,MDA)试剂 盒，南京建成，批号：A003-1。超氧化物歧化酶(su-peroxide dismufase, SOD)试剂盒 ，武 汉华美 ，批号 ： P03037347。大鼠脑立体定位仪，美国K0PF(Model- 900)。Morris水迷宫，上海欣软(XR-XM101)。Y迷宫， 上海软隆(BW-MYM103)。透射式电子显微镜，美国 FEI 公司(Tecnai G2 Spirit)。

2方法

2.1 AD大鼠模型的复制及干预

根据参考文献[8]行Y型迷宫初筛，剔除先天愚 钝的大鼠，随后依据旷场实验水平运动得分将大鼠 分为正常组、假手术组、模型组、西药组、中药组，每 组10只。参照Xi等^[9]方法，复制AD模型。除正常组 夕卜，各组大鼠以10%水合氯醛（350 mg/kg)腹腔注射 麻醉后俯卧固定于脑立体定位仪，常规备皮消毒，头 顶正中切开皮肤，找到大鼠前囟，结合《大鼠脑立体 定向仪图谱》^[10]及预实验结果，在大鼠两侧侧脑室(位 置：前囟后1 mm，矢状缝向左、右侧劳开1.5 mm， 深4.6 mm)用针头钻开颅骨，假手术组两侧侧脑室 注入AP42-1 5 pL，其余实验组缓慢注入Ap_M2 5 pL。 注入时间均为5 min，留针时间5 min，注射完毕后 缝合皮肤，局部红霉素外涂防感染。

正常组不灌胃，其他组造模后隔天开始灌胃。根 据人与大鼠换算系数0.018,以大鼠体质量200 g，成 人体质量60 kg为参考，西药组按0.33 mg/(kg’d)、中 药组按生药量8.1 g/(kg，d)的剂量灌胃，给予药液 8 mL/(kg，d)。模型组和假手术组灌服等容量生理盐 水，连续给药4周。

造模成功标准^[8]:造模结束后第15天，对大鼠再次进行Y型迷宫筛选，如15次测试中正确次数 比造模前下降1/3者为造模成功。共剔除死亡大鼠 5只，造模失败3只，将存活的成功模型纳人下一步 实验，其中假手术组8只，模型组7只，中药组9只， 西药组8只，正常组10只，成模率80%，并遵循随 机原则补齐每组动物为10只。

• Morris水迷宫测试大鼠学习记忆能力

在各组大鼠28 d干预完成后，每天下午14:30 左右开始定位航行训练，连续5 d。每天将大鼠面向 池壁分别从4个平均分布的标记点轻轻放人水中， 记录1 min内其找到水下平台所花费的时间（逃 避潜伏期，escape latency)。第6天移除隐藏的平 台，从定位航行实验的第1个人水点将大鼠放人水 池，记录1 min内大鼠经过虚拟平台的总次数，原平 台象限的活动时间与距离占总游泳时间及总游程 的百分比[^11]。

• ELISA、TBA法分别测定前额皮质组织匀浆及血 清中SOD、MDA活性

水迷宫测试结束后，大鼠用10%水合氯醛 (350 mg/kg)麻醉，腹主动脉采血后，断头取脑，碎冰上 迅速分离出大鼠前额皮质，预冷的生理盐水洗净血zi， 吸干水分后称质量，制备成10%组织匀浆液，分别低 温离心机3 500 r/min离心匀浆液及血液15 min，取 上清，按照SOD、MDA试剂盒说明书操作测定。

2.4电镜观察

大鼠麻醉处死后断头取脑，碎冰上分离大鼠海 马，用2.5%戊二醛固定2 h以上，0.1 mmol/L磷酸 缓冲液清洗3次；1%锇酸固定1~2 h，0.1 mmol/L 磷酸缓冲液漂洗3次；常规50%、70%、90%、100% 丙酮脱水，经过浸泡、包埋、固化后超薄切片机切片， 柠檬酸铅和醋酸铀双染，透射电镜下放大20 000倍

观察并拍照记录。

2.5统计方法

用SPSS l7.0软件进行统计分析，实验数据均 用“x±s”表示，水迷宫逃避潜伏期采用重复测量方差 分析^[12]，其余各组间比较使用单因素方差分析，组间 两两比较使用LSD检验，P<0.05表示差异有统计学 意义。

3结果

3.1 水迷宫定位航行试验

随着训练时间的延长，各组大鼠逃避潜伏期逐 渐缩短。与假手术组比较，模型组第3天开始出现逃 避潜伏期延长（P<0.01);与模型组比较，中药组、西 药组逃避潜伏期第3天开始缩短(P<0.01 )。与西药组 相比，中药组逃避潜伏期稍有延长，但差异无统计学 意义(P>0.05)。见图1、表1

3.2水迷宫空间探索试验

与假手术组相比，模型组大鼠原平台象限游泳时 间百分比及游泳距离百分降低，差异有统计学意义 〇P<0.01);与模型组相比，中药组、西药组游泳时间

及游泳距离的百分比升高(P<0.05或P<0.01);与西 药组相比，中药组原平台象限游泳时间所占百分比 稍有降低，但两者差异无统计学意义(P>0.05)，中药 组原平台象限游泳距离所占百分比降低，两者差异 有统计学意义(P<0.01)。见表2、图2。

表2补肾填髓汤对AD大鼠在原平台象限游泳时间、

距离百分比的影响（X±s,n=10,%)

注：与假手术组比较，〒<0.05，*〒<0.01;与模型组比较，#尸<0.05, ##P<0.01;与西药组比较，▲▲P<0.01

图2各组大鼠空间探索轨迹图

3.3补肾填髓方对大鼠前额皮质组织及血清SOD、 MDA酶活性的影响

与假手术组比较，模型组SOD活性明显下降，MDA 活性显著升高(P<0.01);与模型组比较，中药组、西 药组SOD活性均升高，MDA活性均显著下降(P<0.05或P<0.01);西药组与中药组SOD活性、MDA活性比 较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

3.4补肾填髓方对大鼠海马线粒体的影响

电镜结果显示，正常组和假手术组线粒体形态 清楚完整，大小、形状规则，分布均匀且数目多，外膜 平整光滑，线粒体膜间隙无明显扩张，线粒体嵴排列 整齐呈板层状，内膜和嵴内腔含有较多均匀的颗粒 状基质，未见线粒体水肿及空泡化改变。

模型组部分线粒体形态欠完整，结构不清晰，体 积缩小，大小、形状不规则，分布紊乱且数目减少，线 粒体外膜模糊，内嵴大量断裂或溶解消失，线粒体肿 胀，基质疏松清淡，未见基质颗粒，出现空泡化改变。 中药组、西药组大鼠线粒体组织结构上较为完整清 晰，大小、形状相对规则，数目较模型组增多，外膜可 见，尚光滑，内嵴增多，排列比较整齐，偶可见嵴内腔 稍有扩大，内嵴溶解减轻，部分线粒体肿胀明显改 善，基质较均匀，可见少许基质颗粒。见图3。

图3各组大鼠海马线粒体电镜观察图（X20000)

4讨论

AD是一种与年龄相关的神经系统退行性疾 病，P淀粉样蛋白沉积成老年斑是AD病理标志，并 且被认为直接损害学习能力和记忆^[13]，其中Ap^能

够自我组装形成寡聚体和淀粉样纤维而具有很强的 细胞毒性;A Pw作为它的反序列肽，缺乏了自我组 装及构成毒性寡聚态的能力，不具有细胞毒性，故而 在许多研究中作为APi-2的对照肽^[14]。条件恐惧、放 射状迷宫、Morris水迷宫实验、Y迷宫实验等均是 AD行为学评价的常用方法^[15-16]。AD患者后期多伴 有如幻想、焦虑、抑郁等精神症状，旷场实验是评价 实验动物在新异环境中自主行为、探究行为与紧张 度的一种方法，常用于评价实验动物在新异环境中的 焦虑状态。初期就选择Y迷宫进行初筛，并配合旷 场实验评分，既可避免Morris水迷宫初筛大鼠会遗 留对平台记忆干扰后期Morris水迷宫测试结果，又 可排除大鼠情绪原因引起自主活动差异而影响终 的测试结果。造模后大鼠Morris水迷宫实验测定结 果显示，模型组逃避潜伏期延长，在原平台象限的游 泳时间和游泳距离百分比缩短，假手术组未见明显 变化，表明模型大鼠学习记忆受损。

AD发病机制复杂，多种因素参与了它的发病过 程，其中氧化应激可能在其中占有重要的地位，大量 实验研究及回顾性研究均提出AD发生发展与氧化 应激密切相关^[17-19]。尽管生理浓度的活性氧在体内 的一些信号通路中起着重要作用，但活性氧的过度 产生会引起脂质、蛋白、核酸等分子损伤。MDA是一 种重要的脂质过氧化产物，表明了机体受氧化损伤的程 度。活性氧的消除主要通过酶促及非酶促两种途径， SOD是体内重要抗氧化酶，可通过催化还原态单电 子氧转化为过氧化氢从而清除体内氧自由基，减轻 氧化损伤的程度，维持生物体细胞成分正常的结构 和功能^[20]。通过抗氧化手段进行干预，或可延缓疾病 向AD终末的进展。本实验结果显示，模型组血清及 皮质抗氧化酶SOD活性均有下降，MDA活性均表 现升高趋势；中药组可以升高皮质及血清中的SOD 活性，降低MDA活性。表明补肾填髓方可以增强机 体的抗氧化能力，拮抗过度产生的氧自由基，这与姜 招峰等™的研究有共通之处，其研究表明海马及皮 层部位的氧自由基损伤与大鼠记忆及学习能力密切 相 关。

由于线粒体电子传递中不可避免的出现电子泄 露，成为了机体活性氧主要产生来源，90%内源性氧自 由基均由线粒体而来，线粒体自身亦可受到氧自由基的 破坏，加剧线粒体的损伤，从而形成恶性循环^[22]。本 研究通过电镜观察线粒体超微结构，结果显示模型 组线粒体形态不完整，结构破坏，体积变小，分布紊 乱且数目减少，出现空泡化改变，表明AD模型鼠线 粒体整体结构受损；大鼠灌服中药补肾填髓方能使 线粒体组织结构部分恢复，大小、形状变得规则，数 目增多。表明补肾填髓方对受损的AD大鼠线粒体 结构的破坏有改善作用。

AD属于中医学“痴呆”“呆证”的范畴，病性以 本虚标实为主，以髓海空虚为本，痰浊、瘀血阻络为 标，而肾虚髓空是其根本原因。肾与脑之间有着密不 可分的联系，“痴呆”的中医药治疗多集中在补肾填 髓。老年痴呆临床辨证分型流行病调查也发现，髓海 不足证在所有证型中出现频次zui高^[23]。补肾填髓方 基于经典方剂“孔圣枕中丹”（《千金方》）化裁而成， 以yin羊藿、何首乌为君药，功效在于滋阴补肾、强精 益血；臣药龟板、龙骨强精益髓，增慧添智；佐以远 志、石菖蒲开窍豁痰，醒神益智。纵观全方药物组成， 主要功效在于补肾填髓，且兼顾了化痰开窍。现代药 理研究表明：yin羊藿中的成分yin羊藿苷可以通过抗 氧化应激、抗炎、清除自由基、抑制乙酰胆碱酯酶的 活性以及抑制AP聚集等途径发挥对AD的改善作 用^[24]。何首乌主要水溶性成分二苯乙烯苷可改善拟 痴呆大鼠的学习记忆能力，提高大鼠海马组织CA1 区脑啡肽酶及低密度脂蛋白相关受体1表达，增强 对AP的降解和转运^[25]。远志粗提物经D101大孔吸 附树脂富集后，发现皂苷类成分和黄酮类成分或许能 通过抗氧化应激，改善小鼠的学习记忆功能^m。石菖蒲 的主要有效成分P-细辛醚可以改善认知功能，其作用 机制包括了抑制炎症因子IL-ip、TNF-a的分泌及下 调AQP4的表达来保护星形胶质细胞^[27]。

本实验显示补肾填髓方可以改善AD大鼠的学习 记忆能力，增强抗氧化应激能力，且能够改善线粒体的 结构，其机制可能与改善线粒体相关的氧化应激有 关，更深人的机制研究还需下一步进行。