动物神经行为实验方法

一、Morris水迷宫系统的组成

Morris实验系统由水迷宫装置、水迷宫图像自动采集和SuperMaze软件/VisuTrack分析系统组成。

1、Morris水迷宫装置:主要由装水的水池和一个可调节高度和可移动位置的站台所组成。

2、水迷宫图像自动采集和软件分析系统:该系统的主要部件为摄像机、计算机和图像采集卡等。这种系统有多种型号,但工作原理和流程大致相似:摄像头采集大鼠游泳图像(模拟信号)输入到计算机中的图像采集卡进行模/数转换,大鼠游泳的模拟图像转化为数字图像储存于硬盘中,将数字图像进行图像分析得到有关的测试参数。软件分析系统能自动地采集动物的入水位置、游泳的速度、搜索目标等所需时间、运行轨迹和搜索策略等参数,并可将所采集的各种资料进行统计和分析。

二、硬件选择的注意事项

1、水池和站台

对于水池的大小，存在一个人为选择的问题，看起来应该统一标准，其实并不容易。但是有个原则就是水池不能太小，站台也不能太大。Morris初（1981年）用于大鼠的水池是直径1.32米、高为0.6米，水池的水深为0.40米;但后来（1984年）改为直径2.14米、高0.4米，水池的水深为0.25米。对于小鼠的实验水池，文献中介绍的迷宫直径差异巨大，小到0.6米, 大到2.0米。一般而言，过小的水池使小鼠爬上平台的偶然性增加，任务难度减小。过大的水池会使小鼠游泳路径延长，体力消耗过大，爬上站台的机率减少。

现在国内文献中所用水迷宫水池大多数为大鼠1.6m或1.8m居多，而小鼠一般为1m或1.2m，高0.5m。站台一般为圆形，直径可分为大鼠12cm,小鼠6cm,表面粗糙，高度一般为30cm。国外文献中所用水迷宫水池大多数为大鼠1.8m或2.0m居多，高0.6m,站台直径10cm；而小鼠一般为1m到1.5m，高0.3m站台直径5cm。

型号：XR-XM101

2、 水温

水的温度要求实验过程中恒温。大鼠温度范围一般为25± 1℃，小鼠可能低一些，在18~22℃左右。有文献报道，对小鼠进行了水温对迷宫成绩影响的观察，结果发现27~28℃组的小鼠成绩差，而17~18℃组和21~22℃组小鼠的学习成绩没有区别，所以，我们推荐小鼠水迷宫的实验用21~22℃水。水温对潜伏期影响很大，特别是大鼠，如果温度过高，大鼠在游几次后渐渐适应了迷宫环境，它就会把迷宫当“浴盆”了，放进去以后，就漂浮不动；如果水温过低，大鼠体温下降很快，体力也会耗散太多，大鼠游泳能力不能坚持很久，就会出现有几次潜伏期突然增大的现象。甚至有些老鼠会出现较明显的应激反应，比如说会出现抽筋，腹泻现象。水温一般保持25度左右，另外气温也会导致水温偏差过大，应人为的调节水温。所以就要求在水池的底部装有可以恒定保持水温的加热棒或者其他加热装置了。

3、 光源

要保证水池水面上没有光影，主要是要避免光线在水面的反射问题，以免留在水面的光照影子被软件的采集系统将光影和鼠的影子混淆；如果是白色的水池背景，就可以在水池上方用两根条形的发散日光灯，这样可以减少反射光在水面的背影；如果是黑色的水池背景，就在水池四个象限的上方放置4个60瓦的灯泡或25瓦的管灯，不用功率特别大的灯。灯泡的高度应该足够高，不能被摄像头捕获到。另外还可以在水池四周装一圈帘子（颜色一般是黑色、浅蓝色或者白色），这样可以将光的影子挡住，又保持一定的透光度。同时也可以减少外界的人站在水池旁边某个地方或走来走去，对大鼠形成一个不定的空间参照物。

4、 空间线索（参照物）

水池应该置于一个较大的房间内，池壁上悬挂两个以上物体作为近距离视觉参照物，并在水池外房间内有多种远距离视觉参照物。比如几何图形（正方形、三角形、圆形等）悬挂于水池以外的墙上，高度是必须让大小鼠在游泳的时候看的见的范围，所以应该在其视平线以上，这些几何图形可以是宽5cm至15cm塑料板制成，高度是必须高过站台,可以用1m的线挂在水池周围；这些几何图形一般涂成黑色，因为啮齿类动物对黑色比较敏感；这些几何图形一般不少于3个。另外实验室环境是一个十分重要的因素,实验室的设备、仪器、工作台、椅子、门窗和灯具等陈设的位置和实验人员进行实验操作时所站立的位置都可能被大小鼠看见，如果移动会影响实验结果。因为动物有时会常常利用实验室内固有的环境作为它搜索目标时的参照物。

三、实验流程准则

Morris水迷宫实验主要测定空间学习记忆能力，主要的实验内容有隐蔽站台试验、空间探索试验、反向试验和可视站台试验等。在这里主要介绍下文献里面主要做的隐蔽站台试验和空间探索试验的流程准则。

1、隐蔽站台试验

啮齿类动物第yi次游泳时,一般不会找到藏于水面下的不可见的站台。若动物在入水游泳60～90s以内仍未能找到水池中的站台或未能爬上站台时,实验人员可将动物引导置于站台上站立10～30s,使动物体会站在站台上的感觉,这样从第二次开始,学习成绩就能迅速提高。动物爬上站台后,让动物在站台上站立5～10s。将大鼠从站台上拿下来,休息30～60s以后再进行下一次训练。在一般情况下,正常大鼠在经过4～6个实验日训练后,很快就学会以z快z佳的轨迹搜索到站台的确切位置。

每天开始时，将鼠任意从四个象限（东北、西北、东南、西南）之一面向池壁放入水中，站台放置于东南象限， 每次实验鼠共游泳60～90s来寻找隐藏的站台。如果成功地找到站台，鼠可以得到在站台上的10～30s休息时间；如果60～90s内未能成功的找到站台，就由实验人员将鼠人工置于站台上，且同样给予10～30s的休息时间。有时鼠可能会在10～30s间隔时间到达之前从站台上掉下或跳入水中继续游泳。一旦这种情况发生，则将鼠重新放回站台，并重新计时，使时间间隔到达（10～30s）。这样可以确保每只鼠在每次实验后有相等的时间来观察和获取空间信息。

2、空间探索试验                      

隐蔽站台试验结束24h后，撤除站台。然后任选一相同入水点将鼠放入水中，记录鼠在60s或120s内的游泳路径，记录鼠在原站台象限的停留时间和穿越原站台次数，观察受试鼠的空间定位能力，及在空间探索过程中的变化规律。在电脑屏幕上用圆形环标记出站台原所在位置，这样可以记录穿越原站台所在位置的次数。

实验流程准则：

2.1、实验时间

隐蔽站台试验一般设计天数为4天或者6天，如果是年老体弱鼠可以将天数设计为4天。训练时间一般为60s或90s,也有用120s的，不过现在一般都改用60s了，有人做过实验，大鼠在60～120s之间能够找到隐藏站台的次数差异大约只占其找到平台总次数的5%, 这在统计学上是“小概率事件”。也就是说, 大鼠在60s内找不到隐藏站台的话, 再延长到120s也很难找到。而且60s还可以减小各组的标准差, 可以节约实验时间。但问题并非如此简单，隐蔽站台试验潜伏期应采用重复测量, 由于在统计时, 很多研究将大潜伏期直接纳入统计, 显然, 大潜伏期的不同将不可避免地影响统计结果。所以从统计学上了解不同的大潜伏期到底对Morris 水迷宫实验结果有多大的影响, 如何避免因此带来的系统误差等问题尚有待进一步研究。国外文献报道，如果水池的直径在2m，可以设置单次训练时间为120s,直径在1m至1.5m,选择训练时间为60s, 鉴于此，我们认为训练时间60s较为合适。时间过长，对鼠体力消耗也会过大。

2.2、 实验次数

在隐藏站台试验中，每天训练4次，每个象限每天只被使用一次，一定不要将.大鼠连续地放入同一个象限，因为大鼠可能会凭借位置或其他非记忆信息（如向右转弯）来定位站台。而且，接下来每天的象限顺序应当改变。在空间探索试验中，将大鼠置于水池中追踪120s，这个过程需要重复一次，因为在有些情况下，*实验会观察到一些非正常变量，可能一些老鼠在改变了实验条件后迷失了方向。连续进行的两次实验计算平均值可以减少偏差，可以提供一个较高的精度和对先前学习记忆的较好控制。但是如果实验次数多于两次，将会导致在目的象限活动时间减少，得到不准确的空间探索结果。

2.3、实验动物

并非所有鼠株都适合于Morris迷宫测试，如近交系BALB/c小鼠不能学会该任务（成绩并不随天数的增加而进步），129/SvJ小鼠的学习成绩也偏差；比如129/SvJ株的小鼠由于有年龄相关性视觉病变，在衰老时完成以视觉为基础的学习记忆任务时就会出现困难。在C57BL/6鼠，由于严重的秃头症存在，可能使某些小鼠产生抑郁，加上溃疡性皮炎，终可能影响小鼠的游泳能力而影响实验成绩；将动物浸入水中可能引起内分泌或其它应激效应，后者与脑损害或药理学操作间的相互作用具有不确定性；由于体力消耗太大，体温也丧失过多，一些年老体弱鼠完成任务较困难，甚至会发生溺水死亡的情况；另外，个体间的成绩差异也巨大，比如说，有些正常大鼠放入水中后左右观望打圈确定方向后直接游到台上，说明他记忆力比较好，这个现象是很重要的，有的大鼠游泳速度慢些，所以潜伏期时间比痴呆组还大。所以可以先用别的方法把大鼠初筛一下，然后再来做水迷宫实验。

2.4、实验人员

实验者应与受试动物建立良好的感情,让动物熟悉实验者的身体信息,如气味、相貌等。捕捉动物的动作要温柔,不要刺激动物。忌讳用手抓鼠的尾巴,因为这样会极大的刺激动物。有人建议在实验开始的两三天之前,与鼠亲密接触。实际上鼠的嗅觉很敏感，如实验人员为女性的话，其身上的香水味不同，都会使鼠的情绪发生变化的。

下一篇文章会继续讲解Morris水迷宫实验的统计方法准则、行为学评价指标介绍、实验适用范围以及实验注意事项。如果您也喜欢这些文章，欢迎您邀请您的朋友关注我们，并将文章转发给需要的老师和同学，感谢！