用了许多方法检测小鼠的肝脏、脑部、睾丸等组织的细胞凋亡，其中 TUNEL 法做的多，我购买的试剂盒主要是 roche、 promega 公司，结果大多数成功，偶尔也有失败，下面我把实验中的关键问题与大家共享一下，同时也希望能对初学者有所帮忙。

ATCC细胞 TUNEL实验中关键步骤

1.充分脱蜡和水化

脱蜡可以先 60oC 20 min；而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗，这些以便后面的结合反应充分、均匀；

2.把握好细胞通透的时间

一般根据切片的厚薄，选择蛋白酶k的孵育时间，常用 10-30 min，几 μm 切片用短时间；几十 μm 切片用长时间，通过摸索达到既不脱片，有能够使后面的酶和抗体进入胞内。

3.适当延长 TUNEL 反应液的时间

一般是37oC 1 h，你也可以根据你的凋亡损伤程度，选择更长的时间，可长至 2 h，但要结合你终的背景着色。

4.DAB 显色条件的选择

一般 DAB 反应10 min 左右，结合镜下控制背景颜色，长不超过 30 min；promega 公司提供的 DAB 液（桃红色），不利于辨认棕褐色，我不太喜欢。

5.PBS 的充分清洗

在 TUNEL 反应后和酶标反应后的清洗应十分严格，可增加次数达 5 次，因为这些清洗直接决定后切片的非特异性着色。

6.内源性 POD 的封闭

对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织，我的经验是适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度，可以达到很好的封闭效果，且不影响终的特异性染色。

TUNEL法的实验原理

      ATCC细胞 基本原理：对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让 rTDT 和生物标记的 dTUTP 进入细胞内，在 rTDT 的辅助下 dTUTP 与核断裂的 DNA 3’-OH 结合，再用 HRP 标记的链霉亲和素与 dTUTP 上的 biotin 结合（每个链霉亲和素至少可以再结合 3 个 biotin 分子），后用 DAB、过氧化氢与 SP 上的辣根过氧化物酶HRP发生氧化、环化反应，形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色，终通过计数每张切片上不同视野中 TUNEL 阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。（小编碎碎念：掌握原理是做好实验的先决条件，不少人还以为是抗体抗原反应呢）

       细胞通透的时间选择

       1.蛋白酶 k 的目的是通透细胞膜和核膜，从而使反应试剂充分进入细胞核进行反应，提高阳性率。但浓度过高或孵育时间太长容易脱片，只要不脱片，好像影响不大，其作用类似与 TritonX100 等细胞通透剂。

       2. 蛋白酶K一般工作液浓度为 20 μg/ml,但浓缩液可配制1-10 mg/ml，可用 PBS 配制，也可用蛋白酶K缓冲液（100 mM Tris HCl pH8.0+50 mM EDTA）；然后分装成小份，用完一支再用下一支，-20oC保存 1 个月应该没问题的（重复拿的那支），而一直冷冻的至少可以用半年以上。

       3. 蛋白酶K反应时间一般为10-30 min，具体时间长短与切片厚薄有关，4 μm左右的片子可以用 10 min，但30 μm左右的可用30 min，终通过摸索jia时间。过长易脱片、过短起不到通透效果。

关键试剂操作条件

       DAB 显色反应大约需要10 min，要控制好反应时间，勿使背景颜色过深。具体的可能还是得根据切片组织来源和切片厚度、试剂盒种类不同来摸索一下。

蛋白酶K工作液处理时间、温度须在范围内摸索，温度过高，时间过长，易破坏核酸结构，出现假阳性。

       DNase 1 一般室温，10 min 即可。

 如何减弱非特异性染色

       若是肝脏或肾脏，因富含内源性过氧化物酶，需要增加过氧化氢浓度和延长孵育时间。其他还可以加强灭活、缩短 DAB 孵育时间、PBS 充分清洗，注意镜下把握好着色。

其他注意事项

       1.湿盒用带盖方盘，里面固定几根玻璃吸管用于放玻片，使用时稍加水即可。

       2.英文说明书中对组织细胞通透这一步中，加了“对难处理的组织的处理”，意思是用常规方法处理（如蛋白酶 K)后，应该阳性而做不出阳性时，可用微波修复。

       3.复染的目的是为了衬托组织形态结构，以利于结果分析，石蜡切片常用苏木素，核染成兰色，冷冻切片常用甲基绿，核染成绿色。

       4.PBS 用蒸馏水、Na2HPO4、KH2PO4配制，现在有卖的，自己加蒸馏水稀释后即可用，很方便，也不贵。蛋白酶 K 消化蛋白后，需要用封闭液。

       5. 未打开的试剂盒贮存在-20℃（-15~25℃）；converter -POD液一旦解冻，以后就保存在4℃（2~8℃）下，至少在6 m内稳定，避免再次冻存；TUNEL反应液临用前配好后，放至冰上直至使用。

       6. 结果分析时注意：在坏死的晚期阶段或在高度增殖/代谢的组织细胞中可产生大量DNA断，从而引起假阳性结果；而有些类型的凋亡性细胞死亡缺乏DNA断裂或DNA裂解不*，以及细胞外的矩阵成分阻止TdT进入胞内反应，进而产生假阴性结果

       7.棕色是阳性细胞没错；棕色+蓝色的细胞核为蓝黑色，趋黑色，所以是可以判断的。如果结果片子全是蓝色的，那就是说没有阳性细胞核。实验失败。阳性细胞核可以被染上，只不过是蓝黑色而已。注意分辨。Tunel后镜检一下看看阳性细胞核在什么位置；然后再轻度复染即可。注意比较分辨哪些是阳性细胞。