细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。

一、实验原理：

随着温度降低，细胞内的酶活性会逐渐降低，到-70℃左右，酶活性几乎为0，代谢活动停止，可以实现长期保存。然而，随着温度降低，细胞内外的水分也会“结冰”并形成冰晶，冰晶能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、pH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。因此常加入冷冻保护剂甘油或二甲基亚砜（DMSO）。DMSO能快速穿透细胞膜进入细胞，降低冰点，延缓冻存过程，同时增加细胞膜的通透性，提高细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶的形成，从而达到保护细胞的目的。

二、实验步骤

1. 制备冻存液，冻存液比例：本实验室采用70%基础培养基+20%FBS+10%DMSO，不同实验室及不同细胞可能略有差异，也可采用55%基础培养基+40%FBS+5%DMSO；

2. 取形态良好，处于对数生长期的细胞，对其消化、离心 (1500rpm离心8min)、计数；

3. 根据细胞数量加入对应的冻存液，使细胞密度维持在300-500w/mL；

4. 小心用镊子打开冻存管管盖，每管分装1-1.5mL含细胞的冻存液，拧紧盖管，做好标记。

5. 分装好的冻存管转入程序降温盒后直接放-80℃过夜；

6. 若没有程序降温盒，则按下列顺序依次降温：室温→4℃20min→-20℃30min→-80℃过夜，注意转移过程中要保冷，避免产生温差或冻存管融化；

7. 从-80℃冰箱取出冻存管迅速转移到液氮长期保存。

三、注意事项：

1. 为保持细胞最大存活率，一般都采用慢冻存融的方法。

2. 冻存物距液氮面越近温度越低。标准的低冻速度为－1℃~12℃/分钟，当温度下降达－25℃时，下降速度可增至－5~－10℃/分钟，到－100℃时则可迅速冻入液氮中。因此要适当掌握冻存物下降入液氮中的速度，过快能影响细胞内水分透出，太慢则促冰晶形成。

3. 初次冻存者在下降冻存时，宜先用细木棒伸入罐中探测液面位置，然后需用温度计与冻存物并行的办法，以观测下降冻存物的速度、冻存物与液氮液面距离和温度三者关系，当已掌握以上各参数和冻存技术熟练后，仅按下降时间和下降距离便可获理想冻存效果。

4. 各种细胞对冻存速度的要求也不一样；上皮细胞和成纤维细胞耐受性可能大些，骨髓干细胞－2~－3℃/分钟合适；胚胎细胞耐受性较小，不宜太快。总之在一开始时，下降速度不能超过－10℃/分钟。

5. 用什么防护剂合适和用量多大，要依细胞而定，初代培养细胞用DMSO 较好，一般细胞可用甘油；用量以较小为好。有人认为人皮肤上皮细胞贮存在20%-30%甘油中很好。

6. 原则上细胞在液氮中可贮存多年，但为妥善起见，冻存一年后，应再复苏培养一次，然后再继续冻存。

7. 将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤

8. 注意自身的安全，对于来自人源性或病毒感染的细胞株应特别小心。操作过程中，应避免引起气溶胶的产生，小心有毒性试剂例如DMSO，并避免尖锐物品伤人等。