WB实验流程

WB实验，即Western Blot实验，也被称为蛋白质印迹或免疫印迹，是一种基于抗原抗体特异性结合原理的综合性免疫学检测技术。该技术主要用于检测细胞或组织提取物中的蛋白表达水平，并广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测等多个方面。

以下是WB实验的详细流程：
一、实验前准备
明确目的蛋白：了解所研究的目的蛋白在待测样本中的表达情况、蛋白大小、翻译后修饰等信息。
选择样本：根据实验目的选择合适的细胞或组织样本，并参考相关文献或数据库（如UniProt、NCBI、BIOGPS等）获取样本信息。
试剂准备：配置实验所需的各种试剂，如电泳缓冲液、转膜缓冲液、TBS、封闭液、抗体稀释液等。
二、实验流程
1. 样本制备
样本获取：从细胞或组织中获取样本。
蛋白裂解：使用适当的裂解液（如RIPA裂解液）裂解样本，释放蛋白质。注意在冰上操作以减少蛋白降解，对于磷酸化蛋白检测，需加入磷酸酶抑制剂混合物。
蛋白定量：使用BCA法等方法对提取的蛋白进行定量，确保上样时各泳道的蛋白量一致。
蛋白变性：加入蛋白上样缓冲液，并通过加热使蛋白变性，形成线性结构，便于电泳和抗体结合。
2. SDS-PAGE电泳
制胶：根据目标蛋白的分子量大小选择合适的分离胶和浓缩胶浓度。
上样：将变性后的蛋白样品加入凝胶上样孔中，同时加入预染的蛋白分子量标准（Marker）作为参照。
电泳：在适当的电压下进行电泳，使蛋白根据分子量大小在凝胶中分离。
3. 转膜
选择转膜膜：常用的转膜膜有NC膜和PVDF膜，根据实验需求选择合适的膜。
转膜操作：采用湿转或半干转等方法将凝胶上的蛋白转移到膜上。注意保持膜的湿润和避免气泡产生。
4. 封闭
封闭液选择：常用5%脱脂奶粉或BSA作为封闭液。
封闭操作：将膜放入封闭液中室温封闭一定时间（如1小时），以封闭膜上的非特异性结合位点。
5. 抗体孵育
一抗孵育：将膜放入稀释好的一抗溶液中，在适当的条件下（如4℃摇床过夜）孵育，使一抗与目的蛋白特异性结合。
洗膜：用TBST等洗脱液洗去未结合的一抗。
二抗孵育：将膜放入稀释好的二抗溶液中孵育一定时间（如室温1小时），使二抗与一抗结合。同样需要洗膜去除未结合的二抗。
6. 化学发光与显影
化学发光：将膜放入含有化学发光底物的溶液中孵育一定时间，使目的蛋白所在位置产生荧光。
显影：使用化学发光成像系统对膜进行曝光和拍照，记录实验结果。
三、注意事项
实验过程中需严格控制实验条件，如温度、时间、电压等，以确保实验结果的准确性。
注意避免蛋白降解和非特异性结合的产生，以提高实验的特异性和灵敏度。
在使用抗体时需参照抗体说明书进行操作，确保抗体的稀释比例和孵育条件正确无误。
通过以上流程，WB实验可以实现对细胞或组织提取物中特定蛋白的检测和分析，为科学研究提供有力支持。