免疫组化非特异性染色的八大原因

     免疫组织化学技术（immunohistochemistry），是一项利用抗原抗体反应，通过使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原，对蛋白定位，定性的实验技术。

    然而，结果却未必都是那么如意的，常常出现下面这种状况，好好的一张片子染得脏脏的，这就是常见的非特异性染色。

     1. 抗体问题

     一抗用多克隆抗体容易出现非特异性染色，建议用高纯度，价的针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体来解决。单克隆抗体很贵，不过结果真的很好。尤其是背景非特异性染色不会太深。真是一分价钱一分货。一抗过期也会造成杯具，所以要注意抗体的有效期。

     2. 抗体浓度过高/孵育时间过长

     一抗浓度太高也是出现非特异性染色的常见原因。解决的办法就是预实验。每次使用新抗体前应该多做预实验，摸索出适合的工作浓度，不能简单地按照说明书来用。另一个常见原因就是孵育时间过长。解决的办法就是定时器。加上抗体后，立刻调好定时器，提醒自己及时终止反应，就会避免这个问题。

     3. DAB染色时间太长/变质

     DAB的孵育时间过长，会造成背景非特异性染色。DAB的显色时间不是一成不变的，主要靠自己在显微镜下盯着，一旦出现浅浅的棕色的时候，就要马上冲洗。出现棕色的时间过短，表明抗体浓度过高；出现棕色的时间过长，表明抗体浓度过低。DAB要保存于避光干燥的地方，现用现配，临用前才加入H2O2。图1就冲洗的有些晚了；图2就是刚刚好，染色效果棒棒哒!

     4. 内源性酶和生物素

     内源性酶和生物素也会造成非特异性染色，特别是一些内源性酶生物素含量丰富的组织，如肝脏，肾脏，脾脏等。处理的办法为：灭活碱性磷酸酶：常用的方法是将左旋咪唑（24 mg/mL）加入底物液中，并保持PH值在7.6-8.2，即能除去大部分内源性碱性磷酸酶；对于酸性磷酸酶，可以用50 mmol/L的酒石酸抑制；对于内源性过氧化物酶，可以用0.9%的双氧水来灭活。对于内源性生物素，染色前将切片浸于25 μg/mL亲和素溶液中15分钟，PBS清洗15分钟后即可染色。也可以24 mg/mL的卵白素封片15分钟。

     5. 组织变干

     一下子染太多片子的时候，容易出现这种情况。解决的办法就是不要贪多嚼不烂。一次少染几张。还有就是试剂充分覆盖组织，超出组织边缘2 mm。然后用PAP笔在组织周围画一个圈圈，把试剂圈在里面。避免修复液流走。圈圈应该距离组织边缘3-4 mm。

     6. 浸泡时间过长

     切片在缓冲液或修复液里面浸泡过夜，也会引起杯具。这都是偷懒的做法。但是有时候也是可以偷一下懒的。毛博的独门秘技就是4°C冰箱。只要把容器放在4°C冰箱里，过夜*没有问题。

     7. 清洗不充分

     清洗一定要充分。PBS液一定要双蒸水新配，用之前再次测PH值。缓冲液用0.05 mol/L的Tris-HCL，0.15 mol/L的NaCl即可。如果加一点去垢剂Tween-20就更好了。

     8. 封闭血清问题

     是否选择了正确的封闭血清。原则是选择二抗动物的非免疫血清，例如二抗是羊抗兔，就要选择非免疫羊血清。用PBS稀释为3-10%的溶液孵育切片，37°C 10-30分钟。这里不用洗，直接甩掉即可。