Western Blot 操作步骤多，每一步的失误都会造成全盘失败，从试剂与设备的选择到实验条件的摸索，都很关键。如果初学者想要做好 Western Blot，记住以下的操作技巧，或许能够事半功倍。

   一、蛋白质的样品制备:

    蛋白质在样品处理过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰（加入合适的蛋白酶抑制剂）。

    样品建议分装成合适的量（比如分装出 20μL 检测蛋白质定量用），然后 -20°或 -80℃中长期保存，注意不要反复冻融，因为会使蛋白的抗原特性发生改变。

    切莫使用不新鲜的上样缓冲液，同时在处理时应注意将样品与 loading buffer 混合均匀。

   二、蛋白质定量：

    如果要定量的话，一般选择 BCA 或者 Bradford 方法，BCA 要求检测波长为 562nm，Bradford 为 595nm。具体方法见各试剂盒说明书。为避免假阳性结果，建议先把 lysis buffer 加入 BCA 工作液或考马 G250 混合看是否产生颜色。

    按分子克隆的说法，还是使用等体积上样比较好。上样总体积一般不超过 15μL，加样孔的大限度可加 20μL 样品。

    上样前要将样品置于烧杯内，在沸水中煮 3~5min 使蛋白充分变性。也可以使用 PCR 仪 95℃ 加热 5min，效果佳，操作方便。之后样品可以在 4℃ 冰箱短时间保存，也可在 -20℃ 冰箱保存数月，切勿反复冻融。

   三、SDS－PAGE电泳：

    未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性，操作时应该戴手套防护。

    灌胶时掌握好速度，避免气泡产生（注意浓度越小的胶含水越多，凝固后胶体积缩小越多）。加水液封时速度要很慢，否则胶会被冲变形。

    聚合时间由 AP 以及 TEMED 决定，通常在 30min 左右，AP 不新鲜会导致聚合变慢，气温较低时胶是会凝得慢一些，必要时可适当增加 AP 以及 TEMED 的量，但通常不会超过 1h，若超过 1h 甚至更长仍未聚合，应检查配制的操作有无错误。推荐 APS 每周新鲜配置。

    取适当体积样本混合 1X SDS loading buffer（事前分装好，每次从冰箱里取一管即可），95~100℃ 加热 5min，若有沉淀可用稍低温度，比如 45~55℃ 加热  1h 达到变性的目的。

    加样前可用 5mL 注射器或加样器先冲洗一下加样孔。加入下一个样品前，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤 3 次，以免交叉污染。上样时，小心不要使样品溢出而污染相临加样孔。

    电泳时间和电压说法各异。一般电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。为减少蛋白质条带的扩散，上样后应尽快进行电泳，电泳结束后也应直接或者转印。

   四、转膜：

    我们实验室使用的是半干转膜电泳槽。对于转印 90kd 以下的蛋白，转膜液都不用加 SDS，如果是蛋白分子量大的话可以加入 0.037% 的 SDS 。

    切滤纸和膜时一定要戴干净手套，因为手上的蛋白会污染膜。PVDF 膜使用前用无水甲醇中浸泡 1min~2min。

    在加有转移液的培养皿里放入裁好的胶、浸过甲醇的 PVDF 膜和滤纸，平衡 10min左右，也是为了除去滤纸和转移膜中的气泡以及胶上多余的 SDS。

    用枪头或移液管在叠层的滤纸上滚动，除去气泡。注意每叠一层就要用玻璃棒或圆筒试管赶去气泡，因为一个气泡的厚度对于蛋白来说都是十万八千里的。

    用干净纱布将叠层上面和周围的多余缓冲液吸干。这一步很重要，宁可太干也不能太湿，太干容易烧胡，太湿的话多余的缓冲液会导致电流短路，大大降低转移效率，如果同时转好几条胶的时候更要小心，有一个胶短路就会影响整体的转移效率。

   五、免疫杂交反应：

    如果是自己配置的封闭液，应过滤一下以消除固体杂质。实际经验表明与其封闭过夜，不如一抗孵育过夜。

    一抗一般用封闭液稀释即可，如果背景不高用 TBST 稀释也可以，熟练后还可以配制一些自己的复方稀释液，用后可回收重复用 2~3 次，但回收重复利用的效果如何就要看抗体的质量，分装的抗体不推荐回收。

    二抗作用的时间应严格控制，实践证明一抗时间长点可能没什么关系，而二抗时间若过长过短都将会直接影响结果。二抗孵育之后还要注意好好洗涤，否则显影是背景可能脏。

    后是化学发光（ECL），显影，定影以及凝胶图象分析的步骤，一般来说按照说明书来操作，在此不多赘述。