相对定量原理

  在某些不需要对基因进行绝付定量，只需要确定基因相对表达差异的情况下，如某基因在经过某种处理后表达量是增加了还是减少了，用相对定量的方法就可以得到结果。相对定量是一种更普遍、更简单的方法。机体的细胞中，一些基因的表达量是恒定的，这些基因可以被用作内部参照（简称内参）基因。相对定量就是通过检测目的基因相对于内参基因的表达变化来实现定量的。正确选择内参可以平均起始样本质和量的误差，以及反应效率的误差。内参需满足：①在研究中样本之间的表达是相似的；②处理因素不会影响其表达；③与待测基因同时进行相同的扩增。在开始实验之前，须对所选择的内参进行上述分析。

  一般推荐使用内源性管家基因（housekeeping gene）作为内参基因，管家基因的作用主 要有：①用于与目的基因拷贝数的比较；②作为内对照补偿待测样本核酸抽提过程中造成的目的基因变异，以及反映反应体系内是否存在PCR扩增的影响因素；③参照物标准化。由 于管家基因在各种组织中是恒定表达的，所以可以用管家基因的量作为某种标准，以比较来源不同的样本目的基因表达量的差异。通常选用的管家基因有GAPDH、β2-tublin, β-actin、 efla、Cyclophilin和16SrRNA等。尽管在大多数情况下这些管家基因的表达非常稳定，但是近有报道认为这些管家基因的表达在某些情况下会发生变化。也就是说，并不是任何管家基因都适合任何试验。在选择内参基因时，应仔细考虑各种因素，选择合适的管家基因或管家基因组合。使用管家基因进行相对定量不仅比定量更加简单、经济，而且也更为可靠和准确，但是管家基因毕竞与目的基因存在较大的异源性，所以在反应过程中会出现扩增效率不一致的问题。下面将具体介绍各种相对定量的方法。

 （一）标准曲线法相对定量

  此方法与定量的标准曲线法基本相似。不同之处是定量中只用构建目的基因的标准曲线，而且用于构建标准曲线的标准品的量是预先已知的。而相对定量中需要同时构建目的基因和内参基因两条标准曲线，并且相对定量中所用的标准品不用知道其准确的拷贝数或浓度，只要知道其相对稀释度即可。

  相对定量法中必须选定一个用于表达差异分析的参照体系，而且终得到的结果——未知样品的量是相对于某个参照物的量而言的。该方法的步是制备标准品，包括目的基因的标准品与内参基因的标准品。标准品可以不知道准确拷贝数或浓度，但必须准确地进行倍 比稀释，一般为10倍的倍比稀释。第二步就是分别将系列稀释的目的基因标准品和内参基因标准品制成标准曲线。然后根据标准曲线得出未知样品和参照样品中的目的基因和内参基 因的表达量，并用内参进行均一化，即将目的基因的数量（微克、纳克或拷贝数）除以与之相应的内参基因数量，可以看出，既定目的基因在参照体系中的表达量为1x，那么目的基因在其情况下的表达量以相对于参照体系的n倍表示，当标准品内参照因子与目的基因扩增效率不同时，可以用该方法进行相对定量。

 （二）2-△△Ct法相对定量

  1、介绍

  2^-△△Ct法又称为比较Ct法，其与标准曲线法类似，只不过其是用数学公式来取得同样的相对定量结果，所不同的是其要求靶基因与参比内标具有相同的扩增效率。在基因表达的研究中，一般我们只需要知道某个基因在不同时间或不同组织器官中表达水平的差异即可。所用的内标通常是一些随时间及组织变化不大的管家基因如16srRNA、β-actin、GAPDH等。

  2^-△△Ct表示如果对反应条件进行优化使扩增效率接近1，那么实验样本经过均一化处理后相对于参照样本就是2^-△△Ct

相对倍数（实验组/参照组）=2^-△△Ct

   2、2^-△△Ct法计算

 在进行2-△△Ct 相对定量时实验体系中必须包含实验组和参照组、目的基因和内参基因。

          △Ct目的基因=Ct（目的基因）-Ct（同一样本内参基因）

          △△Ct目的基因=实验组△Ct目的基因-参照组△Ct目的基因

  参照样本的选择根据不同的实验类型确定的，其应用有以下3中情况：

        （1）某种处理方法对基因表达的影响。

        （2）检测基因在不同时间的表达差异。

        （3）比较基因在不同组织或样本中的表达差异。