免疫组化原理

     免疫组化染色是用一抗与被检测组织中目的蛋白抗原结合，然后用HRP等标记的二抗与一抗进行结合，后通过与DAB显色剂反应，进而确认所要检测蛋白抗原的定位、半定量等目的。

—     免疫组化更多的意义在于查看目的蛋白的定位。定量一般用western来实现。

     免疫组化染色和HE染色的不同之处可能是HE染色比较粗略地辨认不同细胞形态学改变；而后者能够针对特异性细胞标志物来检测特异性细胞的改变（数量）、也可检测细胞内细胞因子的转位，组织中一些特异性蛋白的表达的量改变（通过图像分析系统分析颜色深浅、分布的面积等综合分析）。

—     通俗的讲，HE仅仅是看大体病理改变，比如组织坏死，比如炎性渗出。免疫组化，看你的目的蛋白的表达情况。

免疫组化和HE染色的对比

     DAB和HE一样也是一种染色剂，HE染色相对简单，能分辨出细胞中的嗜酸嗜碱性物质；DAB染色全称应该叫做免疫组化DAB染色，经过一系列复杂的生化反应后，DAB(二氨基联苯胺)染色剂能将辣根过氧化物酶染成棕色。

常用的免疫组化染色方法

      组化用HRP的话，信号不够强。通常用生物素标记HRP来增强信号。

   ABC法（卵白素-生物素-过氧化物酶复合物法）

—     ABC法是利用卵白素与生物素*的高度亲和力特性，与生物素化二抗结合，形成抗原＋特异性抗体＋生物素化二抗＋卵白素＋生物素＋HRP复合物，后DAB显色。

—     复合物配制：先将生物素与酶结合，形成生物素化HRP，以生物素化HRP与卵白素按一定比例混合，形成卵白素-生物素-过氧化物酶复合物。

   SP法（抗生物素蛋白链酶素-过氧化物酶复合物）

—     本身没有连接生物素，但有两个生物素亲和力*的结合位点，可以与二抗上的生物素结合，敏感性高，复合物不需要使用前混合，更为简便。

   PAP法

   直接法

样本制备

免疫组化结果分析

    免疫组化结果的判断原则：

—    必须设阳性对照和阴性对照。

—    抗原表达必须在特定部位。

—    阴性结果不能视为抗原不表达。

免疫组化染色实验组与对照组结果分析表 

    从表可以看出只有6、7实验结果有意义。1-5均因对照组的结果已否定Ab的特异性或IHC技术操作存在错误等而使实验结果失去意义，必须重复实验或换用Ab。

染色失败的几种情况及原因

  染色失败的几种情况。

—     所染的全部切片均为阴性结果，包括阳性对照在内。

—     所有切片均呈阳性反应。

—     所有切片背景过深。

—     阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴性反应。

所有切片呈阳性反应，其原因:

—     切片在染色过程中抗体过浓，或干片了。

—     缓冲液配置中未加氯化纳和PH值不准确， 洗涤不*。

—     使用已变色的呈色底物溶液，或呈色反 应时间过长。

—     抗体温育的时间过长。

—     H₂O₂浓度过高，呈色速度过快且粘附剂太厚。

所有切片背景过深，其原因:

—     内源性过氧化酶没有*阻断。

—     切片或涂片过厚。

—     漂洗不够。

—     底物呈色反应过久。

—     蛋白质封闭不够或所用血清溶血。

—     使用全血清抗体稀释不够。

阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴性反应。

—     常见的原因:

     标本固定和处理不当。

注意事项

—     苏木素复染时间需要摸索，尤其要考虑阳性染色的位置。

—     切片脱蜡和水化要充分；加反应液时要覆盖组织充分；每次加液前甩干洗涤液，但又防止干片。

—以下原因可能导致片子着色不均匀：

     ①脱蜡不充分。可以60℃烤20min，立即放入新鲜的二甲苯中。

     ②水化不全。应经常配制新鲜的梯度乙醇。

     ③抗体没混匀。用移液器充分混匀一抗/二抗等试剂。④抗体孵育时，切片放倾斜。

     ⑤抗体孵育后PBS冲洗不充分。

     ⑥制片厚薄不均匀等问题。

     ⑦染片盒不平，切片倾斜。

—一抗的清洗:

     单独冲洗，防止交叉反应造成污染。

     温柔冲洗，防止切片的脱落，推荐用浸洗方式。

     冲洗的时间要足够，才能*洗去 结合的物质。

—PBS的PH和离子强度的使用。

     建议PH在7.4-7.6浓度是0.01 M。

     中性及弱硷性条件（PH7-8）有利 于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利 于分解。

—拍照

     有条件的话应该立即拍照，若不能及时拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和湿度。