样本来源   

对于IHC，组织是来自患者或动物，经过冷冻或石蜡包埋。然后切成约4μm厚的切片。对于ICC，大部分细胞外基质被去除，只剩下整个细胞来染色，来源可以是细胞悬液，或组织培养细胞系。

然而IHC远远不止于把抗体放在组织切片上、然后用显微镜观察那么简单。要想得到实用、可靠而清晰的结果，就需要耐心的对每一步进行优化。根据标记物的不同分为免疫荧光法和免疫酶法，R&DSystems的网站列出了IHC/ICC实验设计和优化的变量及影响因素如下：

样本类型：组织或细胞

样本制备：组织（石蜡或冰冻），细胞：（贴壁细胞或细胞悬液）

适当对照：无一抗，组织类型。

固定方法：灌注或浸泡。

固定剂：甲醛，醇类，丙酮。

封闭液：正常血清，牛血清蛋白（BSA）或脱脂奶粉。

抗原修复：蛋白酶，加热。

检测方法：直接或间接

一抗：物种

二抗：物种

标记物：荧光或酶（显色）

复染剂：苏木精或DAPI（荧光）

封片剂：抗淬灭或水性

显微镜观察：荧显微镜或光学显微镜

处理不同样本的区别 

ICC需要透化，要么通过固定过程，要么是单独的透化步骤，而IHC可能不需要单独的透化步骤，这取决于切片的厚度和固定方法。包埋在石蜡中的组织样本在抗体染色前需要进一步处理。一旦处理好样品，IHC和ICC的染色操作就几乎没什么差异了。

样本固定和制备

组织石蜡包埋前的组织固定：4%甲醛固定剂是组织灌注和浸润固定的常用溶液，一般需要4–24h，能很好地保留组织形态，切片机切片，贴附于载玻片干燥，石蜡切片存储室温多年，后续进行IHC/ICC之前需要再水化，需要抗原修复。

培养细胞固定：2%甲醛室温固定20min，细胞样本贴附载玻片，对于贴壁细胞直接放在6孔或24孔底部的无菌载玻片上生长，悬浮细胞可通过与包被多聚赖氨酸的载玻片孵育10min而附着在载玻片上。

冰冻组织切片固定：切片后用醇类固定，用于检测磷酸化依赖的表位，在低温箱进行样本切片，冰冻切片存储–80℃多达一年。通常保留酶的活性和抗原功能，不需要抗原修复，冰晶的形成可能负面影响组织结构。