ABIPrism7000型荧光定量PCR仪快速入门指南

一.开机

1.确认电脑与主机的数据通讯线(灰色USB连线)连接正确。

2.确认电脑处于外接电源供电状态。

3.启动电脑,以Administrator用户名登录,进入Windows2000操作系统。

4.待桌面图标出现后,打开7000主机的电源。

5.待主机的电源指示灯点亮后,启动7000SDS应用软件。

在进行实验之前,请先检查样品加热模块以确定它没有受到荧光污染,具体方法请按照第6节的“荧光污染的检查与处理”流程进行。

二.实时定量的软件运行

基因表达的定量和相对定量研究、转基因食品的检测(GMO)、各种病原体的检验检疫等各种定量应用;以CT值的大小作为样品阴性、阳性判定依据的定性应用;以及SNP检测、等位基因鉴定实验等的步PCR扩增,都是采用实时定量模式,按照以下步骤操作。

1.新建文件菜单File→New,Assay选择AbsoluteQuantification(实时定量模式),打开一个空白的96孔板文件。

2.探针设置双击任意一个孔,打开WellInspector窗口，该窗口也可从菜单View→WellInspector打开。

3.使用软件,或探针(Detector)没有设置好,请点击AddDetector按钮,打开DetectorManager窗口。该窗口也可以从菜单Tools→DetectorManager打开。如果Detector列表中没有合适的探针,点击按钮File→New,新建探针:设定探针的名称(建议使用所研究基因符号,如GAPDH、ACTIN等)、报告基团(FAM或者VIC)、淬灭基团(TaqMan探针选TAMRA;MGB探针选None)、颜色(任意)等。设置完成后点击OK,该探针即出现在探针列表中。重复此过程,设立其他的探针。

4.在DetectorManager窗口,从探针列表中点击选择所需探针,按住Ctrl键可以选择多个探针,再点击AddtoPlateDocument按钮。后点击Done关闭DetectorManager窗口。此时WellInspector窗口仍然是打开的。

5.填样品表在96孔表中选定有样品的一个或多个孔,在WellInspector页面的SampleName栏中填入样品名称;在探针列表的Use项下的方框中,打钩选择要用的一个或多个探针;在Task栏中选择样品类领:阴性对照选NTC;未知样品选Unknown;标准品选Standard。对于Standard,还要在Quantity栏中输入DNA拷贝数。注意:只有在这里输入拷贝数后,软件才能自动生成标准曲线。建议标准品的浓度在5点以上。建议每个样品(包括标准品)都按照统计学要求作一定数量的复管。

6.参比荧光如果使用的是ABI公司的定量PCR试剂,如TaqManUniversalPCR

MasterMix或者SYBRGreenPCRMasterMix等,参比荧光(PassiveReference)选ROX;如果使用的试剂中不含有参比荧光,请选None。完成后点击右上角的X按钮,关闭WellInspector窗口。

7.循环参数切换到Instrument页面,设定及修改PCR热循环程序:在ABI公司默认的程序中,50°C2min是UNG酶起作用的步骤,UNG酶可以预防其他PCR扩增的产物(其中以U代替T)对定量PCR的污染;95°C10min的作用是激活Taq酶,同时灭活UNG酶;40个循环的95°C15sec和60°C1min是定量PCR的循环步骤。7000默认在后一步,也就是60°C1min复性和延伸时收集荧光信号。如果使用ABI公司的定量PCR试剂,上述参数不需要调整,直接运行PCR循环就可以了。在使用其他厂家试剂的情况下,如果其中没有UNG酶,请删除50°C2min步骤;如果使用的不是Taq酶而是其他普通的Taq酶,请删除95°C10min步骤。

8.循环参数的修改方法删除:按住Shift键并在相应的Stage或Step中点击,该步骤9.其他设置反应体积:定量PCR的标准反应体积是50μL;如果想修改的话,建被选中变黑,按Del键即可删该步骤或循环。插入:在需要插入参数的位置点击,出现粗黑竖线后,分别点击AddHold、AddCycle或AddStep按钮添加保温、循环或循环中的一个步骤。修改温度和时间:拖动鼠标,选中需要修改的温度或时间数字,输入新的数值即可。议大于25μL。融解曲线试验:在DissociationProtocol选项左边的方框中打钩,仪器即在定量PCR循环完成后继续做融解曲线试验。如果是用SYBRGreenI染料方法进行定量研究,建议进行融解曲线试验,以判定PCR反应特异与否。单峰表示单一的PCR扩增产物,多峰表示PCR扩增有杂带。注意:只有SYBRGreenI染料方法才需要进行融解曲线试验,TaqMan探针和MGB探针法都不需要。9600Emulation:选中此项,即可使7000的升降温速度减慢,与9600和7700一样,从而可以直接使用在9600、7700型PCR仪上优化好的循环条件,而不需任何修改。

10.启动扩增点Save按钮保存文件设置。确认96孔板或全部样品管在主机内放置妥当后,点击Start按钮,开始PCR循环。屏幕上动态显示PCR进程和剩余时间。

11.监控进程切换到Results页面的AmpPlot子页面,可以实时显示PCR曲线随着循环增加而逐步增长的实际情况。如果Detector选FAM或VIC,只显示对应探针的变化情况;如果选All,则同时显示所有探针的反应进程。

12.保存结果程序结束后,点Disconnect按钮,然后File→Save保存实验结果。可以保存为.sds格式,也可以保存为.sdt格式,作为以后同类实验的模板,节省软件设置时间。

三.实时定量的数据分析

1.数据分析切换到Result页面,进入扩增曲线(AmplificationPlot)子页面,查看软件已经自动分析好的实验结果。注意:此时的数据是软件根据默认值(基线起点为3,终点为15)得到的初步结果,还需要根据本次实验的具体情况,精细调节Baseline(基线)的起止点后,重新分析,以得到更的数据。

2.基线的起点和终点确定原则基线(Baseline)是指PCR开始时信号很低、接近背景且比较平稳的那个阶段。起点要避开开始几个循环由于高温导致的信号增高,设在信号已经降到背景高度且能维持平稳的地方,一般在3到6个循环之间;终点要避免覆盖信号已经开始有明显增长的地方,一般在本组数据中小的CT值前再3个循环处。另外,起点与终点之间能间隔8个循环以上,以满足统计基线标准偏差的数学要求。调整好起止点以后,再点击Analyze按钮,软件即自动计算新的阈值和CT值,并更新实验报告。注意:此时扩增曲线页面上显示的阈值数字并不更新,但是这不影响后台数据运算的准确。

3.线性图谱在默认的设置中,PCR扩增曲线图谱的纵坐标代表经过ROX和空白校正后的相对荧光信号强度,横坐标代表PCR循环次数(从1到40);纵坐标以对数表示,横坐标以线性表示。如果要看*线性的S形图谱,请双击纵坐标轴线,打开坐标设置窗口,将纵坐标改成线性形式。

4.原始数据切换到Component子页面,察看原始数据。正常的FAM信号强度,基线时约为5000点,扩增完成达到约28000点,中间呈S形增长;TAMRA和ROX的信号开始时都比FAM的基线要稍低一点,TAMRA信号到指数增长阶段会降低,而ROX信号是水平稳定的,不随PCR进程而改变,因为ROX是以固定浓度加入到PCR试剂中的,它本身并不参与PCR扩增。

5.原始数据切换到Spectra子页面,也可以察看原始数据。Spectra与Component这两个页面的区别是:Component显示的是信号强度随时间(即PCR循环次数)的变化,是纵向的;而Spectra显示的是每个PCR循环点上信号强度在不同波长上的分布,也就是在4个滤色片上的分布,是横向的。

6.标准曲线切换到StandardCurve子页面,察看标准曲线。注意:只有在Setup时输入标准品的拷贝数后,软件才能自动生成标准曲线。

7.实验报告切换到Report子页面,察看实验报告。确认无误后,保存结果。也可以从File菜单中选择Export,再选择数据类型,输出各种类型的数据,包括CT值、相对信号强度、原始数据、融解曲线数据和实验结果等。输出的数据可以用Excel打开,并可在Excel中重新生成扩增曲线、标准曲线等图谱。

四.终点读板的软件运行

各种等位基因鉴定实验,包括SNP检测、基因突变检测等,都包括两个阶段:1、PCR扩增;2、扩增后的荧光信号读取(Post-read)和数据处理。步既可以在9700、9600等普通的PCR仪上进行,也可以在7000、7900等定量PCR仪上进行;第二步必须在定量PCR仪上进行。以下只叙述第二步Post-Read和数据处理的操作方法。如果步也在定量PCR仪上进行,请按第三节实时定量的实验方法设置和运行软件;待PCR完成、数据保存好后,再将同一块板放在7000上,按以下步骤操作。

1.新建文件菜单File→New,Assay选择AllelicDiscrimination(终点读板模式,用于SNP分析等),新建一个空白96孔板文件。

2.探针设置双击任意一个孔,打开WellInspector窗口。该窗口也可以从菜单View→WellInspector打开。

3.使用软件,或者Marker没有设置好,先点击AddDetector按钮,打开DetectorManager窗口。该窗口也可以从菜单Tools→DetectorManager打开。如果Detector列表中没有合适的探针,File→New,新建探针,设定探针的名称(建议使用等位基因的名称,如Allele1、Allele2等)、报告基团(FAM或者VIC)、淬灭基团(TaqMan探针选TAMRA;MGB探针选None)、颜色(任意)等。设置完成后点击OK,该探针即出现在探针列表中。

4.位点设置Detector设置好后,点击AddMarker按钮,打开MarkerManager窗口。该窗口也可以从菜单Tools→MarkerManager打开。如果在Marker列表中找不到合适的探针,点CreateMarker,取名(建议使用位点的名称,如D2S1356等),OK,新位点的名字即出现在左边的位点列表中,选中位点,在右边的探针列表中打钩选择与该位点配套的探针,一般FAM、VIC各一个组成一套。

5.选择位点Marker设置完成后,在左边的位点列表中选中该Marker,点击CopytoPlateDocument按钮,该Marker的信息即分成3行出现在WellInspector窗口中。重复选好全部所需Marker,再点击Done关闭MarkerManager窗口。注意:定量PCR实验只要求设置探针(Detector)即可,而SNP实验既要设置探针(Detector),还要设置位点(Marker)。如果没有设置Marker,软件将不能进行基因分型。

6.填样品表在96孔表中选定有同类样品的一个或多个孔,在WellInspector页面asterctor窗口。的Marker列表的Use项下的方框中打钩,选择要用的Marker,然后在探针的Task栏选择样品类型:阴性对照选NTC;未知样品选Unknown。没有Std。

7.参比荧光如果用的是ABI公司的PCR试剂,如TaqManUniversalPCRMMixwithorwithoutUNG,参比荧光(PassiveReference)选ROX;如果所用试剂中不含ROX参比荧光,请选None。点击右上角的X按钮关闭WellInspe。

8.循环参数切换到Instrument页面。PCR热循环程序只有60°C一个步骤,不需要修改。设置反应体积。SNP的标准反应体积是50μL。点Save按钮保存文件设置。

9.终点读板确认96孔板或全部样品管在主机内放置妥当后,点击Post-read按钮,nect按钮,然后File→Save保存实验结果。

10.保存结果程序结束后点Discon

五.终点读板的数据分析

Allelicdiscrimination子页面,在Marker下拉菜单X轴的是VIC信号,中选面看实验报告。确认无误后,保存分析结果。也可以开始读取数据,大约10秒完成。

1.数据分析切换到Results页面中选择要查看其数据的Marker,在下面96孔板界面中按Excel方式选择需要查看的样品孔,软件即在中间的图谱上显示信号的分布情况。选择不同的Marker,显示不同的信号。可以点击放大或缩小工具调整图谱的大小。

2.信号分布正常的信号应该分为4组,靠近原点处为NTC;靠近是纯合子,其正常信号强度范围在2-8之间;靠近Y轴的是FAM信号,是另一种纯合子,其正常信号强度范围在4-16之间;靠近对角线位置的样品中既有FAM信号也有VIC信号,是杂合子,强度为FAM和VIC各自的一半左右。

3.基因分型点击套索工具,然后通过鼠标圈定NTC信号,在Call下拉菜单NTC,这些数据点即被分型为NTC并显示相应的颜色和图标;同样分型FAM纯合子、VIC纯合子和杂合子。

4.保存结果切换到Report页从File菜单中选择Export,再选择数据类型,输出各种类型的数据。

六.日常维护

1.荧光污染的检查与处理新建一个空的96孔板,菜单Instrument→Calibrate打开ROIInspector窗口,将ExposureTime调到4096,选定FilterB,点击Snapshot按钮(不要动下面两个按钮,以免ROI设置出错),此时可以看到排列整齐的96孔图像。如果观察到特别明亮的光斑,则表明该孔存在荧光污染。将光标移动到单个孔的上方可在右侧栏中的PixelIntensity处读出该孔的荧光信号值,超过500以上的需要清洗。清洗时尽量使用较细且无硬物突出的干棉签擦拭;如果未能去除,可用去离子水清洗;如污垢顽固,可使用90%乙醇清洗,但要等乙醇*挥发干净后方可盖上热盖,以免有机溶剂损伤热盖上的透镜组。

2.检测器光源的更换流程关机冷却约15分钟后,打开仪器顶部盖板,拧松灯泡保护罩的螺钉,取下保护罩,将灯泡拆下,更换新的灯泡并插好连线。注意:备用的新灯泡必须保存在干燥环境中。