1.1样本前处理

每份组织分别从3个不同的位置称取样品约1g，手术剪剪碎混匀后取0.5g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至1.5mL灭菌离心管中，8000rpm 离心2min，取上清液100μL于1.5mL灭菌离心管中；棉拭子直接取100μL提取。

1.2RNA提取

推荐采用RNA提取试剂盒（离心柱提取法），请按照试剂盒说明书进行操作。

2.试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照；样品每满7份，多配制1份)，每测试反应体系配制如下表：

试剂AIV-H7N9 反应液 酶液

用量20μL 1μL

将混合好的测试反应液分装到PCR反应管中，21uL/管。

3.加样（样本处理区）

将步骤1提取的RNA、阳性质控品、阴性质控品各取4μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

4.PCR扩增（核酸扩增区）

4.1将待检测反应管置于荧光定量PCR 仪反应槽内；

4.2设置好通道、样品信息，反应体系设置为25μL；荧光通道选择：检测通道（Reporter Dye）FAM、CY5，淬灭通道（Quencher Dye）选择NONE，ABI系列仪器请勿选择ROX参比荧光，选择None即可。

4.3推荐循环参数设置：

步骤循环数温度时间收集荧光信号

1 1cycle 42℃ 20min 否

2 1cycle 95℃ 10min 否

3 40cycle 94℃ 15sec 否

55℃ 30sec 是

5.结果分析判定

5.1结果分析条件设定

设置Baseline和Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节Baseline的start值(一般可在3~15范围内调节)、stop 值(一般可在5~20范围内调节)，以及Threshold的Value值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。

5.2结果判断

FAM通道为禽流感病毒H7N9亚型H7基因检测结果，CY5通道为禽流感病毒

H7N9亚型N9基因检测结果

阳性：检测通道Ct值≤35.0，且曲线有明显的指数增长曲线。

可疑：检测通道Ct值>35.0，且出现明显扩增曲线的样本建议重复试验，重复试验结果出现Ct值≤35.0和明显扩增曲线者为阳性，否则为阴性。

阴性：样本检测结果无Ct值且无明显的扩增曲线。

6.检测方法的局限性

样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定

量检测不准确的结果；

本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

7.质控标准

阴性质控品：无明显扩增曲线且无Ct值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且Ct值≤32；

以上条件应同时满足，否则实验视为无效。