【产品名称】

商品名称：猪轮状病毒（PRV）核酸检测试剂盒（荧光 PCR 法）

Name：Porcine Rotavirus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包装规格】25T/盒、50T/盒

【预期用途】

猪轮状病毒病是由猪轮状病毒感染引起的以急性腹泻为特征的急性肠道传染病，临床上以水样腹泻，呕吐，嗜睡脱水，厌食，迅速消瘦为主要特点，目前尚无特-效-药物进行针对性治疗，疫苗免疫效果也参差不齐，   给养猪业带来严重的经济损失。猪轮状病毒 A 型是引起仔猪（包括断奶前后的）腹泻最常见的亚型，在由猪轮状病毒引起商品化猪群的所有腹泻病中占 90%上。

本试剂盒适用于检测猪科研样品（猪小肠和新鲜粪便）或细胞培养物中猪轮状病毒的 RNA，适用于猪轮状病毒感染的辅助检测。

【检验原理】

本试剂盒采用 TaqMan 探针法实时荧光 PCR 技术，设计一对猪轮状病毒特异性引物，结合一条特异性探针，用荧光 PCR 技术对猪轮状病毒的 RNA 进行体外扩增检测，用于科研实验中对可疑感染者的病原学检测。

【试剂组成】

包装规格25T/盒50T/盒

PRV 反应液500μL×1 管500μL×2 管

酶液25μL×1 管50μL×1 管

PRV 阳性质控品50μL ×1 管50μL ×1 管

阴性质控品250μL ×1 管250μL ×1 管

说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。

【适用仪器】

ABI7500、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

采集腹泻急性期的小肠（5.0cm~10.0cm）或新鲜粪便（5.0g~10.0g），放到密封袋中，置于带有冰袋的保   存箱中，送至实验室[1]。

【保存和运输】

采集或处理好的样品在 2℃~8℃条件下保存应不超过 24 h；若需长期保存，应放置-70℃以下保存，冻融不超过 3 次。

【使用方法】

1.样品处理（样本处理区）

1.1样本前处理

小肠样品：取 5.0cm~10.0cm 小肠组织，用剪刀剪碎，加入 10mL PBS，用适宜规格的组织研磨器或研钵研磨后转移到适宜玻璃瓶中，每毫升样品加入 RNA 酶抑制剂 RRI（40U/μL）500μL，-20℃反复冻融 3 次后，摇匀，取 1.0mL 到 1.5mL 离心管中，经 12000 r/min 离心 5min，取 500μL 上清备用。

粪便样品：取 0.5g~1.0g 新鲜粪便，加入到含 5.0mL~10.0mL 样品处理液（配方参考 GB/T 34756-2017 猪轮状病毒病病毒 RT-PCR 检测方法的规范性附录 A.2）的玻璃瓶中，每毫升样品加入 RNA 酶抑制剂 RRI（40 U/μL）500μL，-20℃反复冻融 3 次后，摇匀，取 1.0mL 到 1.5 mL 离心管中，经 12000 r/min 离心 5min，取500μL 上清液备用。

细胞培养物样本：取细胞培养物，每毫升样品加入 RNA 酶抑制剂 RRI（40 U/μL）500μL，反复冻融 3 次， 经 2000 r/min 离心 10min，取 1mL 上清备用[ 1]。

1.2核酸提取

推荐采用公司生产的核酸提取或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提取，   请按照试剂说明书进行操作。

2.试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N（N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；反应管数每满 10 份，多配制 1 份），每测试反应体系配制如下表：

试剂PRV 反应液酶液

用量（样本数为 N）19μL1μL

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，20μL/管。

3.加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀， 短暂离心。

4.PCR 扩增（核酸扩增区）

4.1将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；

4.2设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM，淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择 None 即可。

4.3推荐循环参数设置：

步骤循环数温度时间收集荧光信号

11 cycle50℃10min否

21 cycle95℃2min否

345cycles95℃15sec否

60℃30sec是

5.结果分析判定

5.1结果分析条件设定（请参照各仪器使用说明书进行设置，以分析 ABI7500 仪器为例）

反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用户可根据实际情况自行调整，Start 值可设在 3～15、End 值可设在 5～20，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击 Analyze 自动获得分析结果。

5.2结果判断

阳性：检测通道 Ct 值≤40，且曲线有明显的指数增长曲线； 阴性：样本检测结果 Ct 值>40 或无 Ct 值。

5.3质控标准

阴性质控品：无特异性扩增曲线或无 Ct 值显示；阳性质控品：扩增曲线有明显指数增长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

6.检测方法的局限性

1.样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

2.样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

3.阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

4.病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

5.不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

6.试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；

7.本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

【注意事项】

1.所有操作严格按照说明书进行；

2.试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完-全混匀并短暂离心；

3.反应液应避光保存；

4.反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

5.使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；

6.样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

7.实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

8.试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

【参考文献】

[1] 国家市场监督管理总局. GB/T 34756-2017 猪轮状病毒病病毒 RT-PCR 检测方法[S].