【产品名称】

商品名称：猪轮状病毒 A 组（PRV-A）核酸检测试剂盒（荧光 PCR 法）

Name：Porcine Rotavirus Group A Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包装规格】50T/盒

【预期用途】

本试剂盒适用于检测猪临床样品（猪小肠和新鲜粪便）或细胞培养物中猪轮状病毒 A 组的 RNA，适用于猪轮状病毒 A 组感染的辅助检测。

【检验原理】

本试剂盒采用 TaqMan 探针法实时荧光 PCR 技术，设计一对猪轮状病毒 A 组特异性引物，结合一条特异性探针，用荧光 PCR 技术对猪轮状病毒 A 组的 RNA 进行体外扩增检测，用于科研实验中对可疑感染者的病原学检测。

【试剂组成】

包装规格50T/盒

PRV-A 反应液500μL×2 管

酶液50μL×1 管

PRV-A 阳性质控品50μL ×1 管

阴性质控品250μL ×1 管

说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。

【适用仪器】

ABI7500、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

采集腹泻急性期的小肠（5.0cm~10.0cm）或新鲜粪便（5.0g~10.0g），放到密封袋中，置于带有冰袋的保   存箱中，送至实验室[1]。

【保存和运输】

采集或处理好的样品在 2℃~8℃条件下保存应不超过 24 h；若需长期保存，应放置-70℃以下保存，冻融不超过 3 次。

【使用方法】

1.样品处理（样本处理区）

1.1样本前处理

小肠样品：取 5.0cm~10.0cm 小肠组织，用剪刀剪碎，加入 10mL PBS，用适宜规格的组织研磨器或研钵研磨后转移到适宜玻璃瓶中，每毫升样品加入 RNA 酶抑制剂 RRI（40U/μL）500μL，-20℃反复冻融 3 次后，摇匀，取 1.0mL 到 1.5mL 离心管中，经 12000 r/min 离心 5min，取 500μL 上清备用。

粪便样品：取 0.5g~1.0g 新鲜粪便，加入到含 5.0mL~10.0mL 样品处理液（配方参考 GB/T 34756-2017 猪轮状病毒病病毒 RT-PCR 检测方法的规范性附录 A.2）的玻璃瓶中，每毫升样品加入 RNA 酶抑制剂 RRI（40 U/μL）500μL，-20℃反复冻融 3 次后，摇匀，取 1.0mL 到 1.5 mL 离心管中，经 12000 r/min 离心 5min，取500μL 上清液备用。

细胞培养物样本：取细胞培养物，每毫升样品加入 RNA 酶抑制剂 RRI（40 U/μL）500μL，反复冻融 3 次， 经 2000 r/min 离心 10min，取 1mL 上清备用[ 1]。

1.2核酸提取

推荐采用公司生产的核酸提取试剂（离心柱法）进行核酸提取，请按照试剂说明书进    行操作。

2.试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N（N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；反应管数每满 10 份，多配制 1 份），每测试反应体系配制如下表：

试剂PRV-A 反应液酶液

用量（样本数为 N）19μL1μL

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，20μL/管。

3.加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀， 短暂离心。

4.PCR 扩增（核酸扩增区）

4.1将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；

4.2设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；

荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM，淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择

ROX 参比荧光，选择 None 即可。

4.3推荐循环参数设置：

步骤循环数温度时间收集荧光信号

11 cycle50℃10min否

21 cycle95℃2min否

345cycles95℃15sec否

60℃30sec是

5.结果分析判定

5.1结果分析条件设定（请参照各仪器使用说明书进行设置，以分析 ABI7500 仪器为例）

反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用户可根据实际情况自行调整，Start 值可设在 3～15、End 值可设在 5～20，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击 Analyze 自动获得分析结果。

5.2结果判断

阳性：检测通道 Ct 值≤40，且曲线有明显的指数增长曲线； 阴性：样本检测结果 Ct 值>40 或无 Ct 值。

5.3质控标准

阴性质控品：无特异性扩增曲线或无 Ct 值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数增长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

6.检测方法的局限性

1.样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

2.样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

3.阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

4.病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

5.不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

6.试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；

7.本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

【注意事项】

1.所有操作严格按照说明书进行；

2.试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完-全混匀并短暂离心；

3.反应液应避光保存；

4.反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

5.使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；

6.样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

7.实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

8.试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

【参考文献】

[1] 国家市场监督管理总局. GB/T 34756-2017 猪轮状病毒病病毒 RT-PCR 检测方法[S].