一、计数生物指示剂分类：

1、滤纸片类：孢子载体为滤纸

1）与培养液分离，灭菌完毕将培养液与滤纸片接触，依据培养液颜色变化确认灭菌效果。

2）不含培养液，灭菌完毕接种至培养基培养，依据培养基浑浊与否确认灭菌效果。

2、孢子悬液类：孢子载体为液体，直接分散于培养液中，一般整体为安瓿包装，灭菌完毕直接培养，依据培养液颜色变化确认灭菌效果。

3、不锈钢片类：孢子载体为不锈钢片（圆形或长条形），不含培养液，灭菌完毕接种至培养基培养，依据培养基浑浊与否确认灭菌效果。

二、滤纸片类生物指示剂计数方法

1、检验所需仪器及物品：

1）仪器：

生物安全柜、通用水浴、振荡器、培养箱、100~1000μl移液枪、计时器。

2）培养基：

胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA），至少200ml/瓶×1瓶，融化后45~50℃水浴保温不超过8h

3）灭菌物品：

a）90mm平皿×8个、1ml带滤芯枪头×1盒（含枪头至少20个，灭菌前先用剪刀剪短头端约2mm，防止滤纸堵塞影响计数结果）、直径4-6mm玻璃珠24个、50ml平底试管×4支，经湿热灭菌124℃、50min后备用，效期内。

b）无菌纯化水：9ml/支试管×12支，100ml/瓶三角瓶×1瓶，经湿热灭菌121℃、15min后备用，效期内。

c） 具体灭菌程序按各灭菌器使用及维护标准操作规程进行。

d）其他物品：

温度控制管：1套，包含10ml纯化水的试管中同时插入1支水银温度计（温度范围50~100℃）；

酒精灯、不锈钢剪刀、刀片、不锈钢镊子、无菌75%酒精棉球（效期内）、记号笔等。

2、 检验环境条件：

阳性对照室活菌操作区的生物安全柜内。

3、检验前准备：

1） 预热通用水浴，设定温度为99.0℃。

2）人员和物品按照《微生物检验用实验室人物流进出标准操作规程》入室。

4、检验步骤：

1）取待检滤纸片类生物指示剂4支，确认生物指示剂外型完整无破损。

2）用不锈钢剪刀剪开或刀片划开塑料管盖或其他包装，用无菌镊子取出滤纸片，将滤纸片加入1支无菌平底试管中，在该试管中加入5ml的无菌纯化水及6颗无菌玻璃珠，平行制备4管，分别记为A、B、C、D管。

3）将4根平底试管放在振荡器上分别振荡7min，直到滤纸条浸渍成浆状（如下图所示），再在每管中加入5ml无菌纯化水，再次振荡8min。

4）将温度控制管放入已预热的水浴中，当温度控制管中温度显示达到或超过95.0℃时，将振荡后的4支平底试管（含10ml无菌纯化水、玻璃珠及*浸渍的滤纸）放入水浴中，使用计时器开始计时，在95~100℃持续热击15min。

5）热击完毕后，立即将4支平底试管取出，置于冰浴（0~4℃）中5min（计时器计时）。

6） 取冰浴后的4支试管按下述方法操作。

7）取A管平底试管（10-1），用移液枪从试管中吸取1ml试管中的溶液至无菌纯化水管（9ml/支）中，记为10-2，在振荡器上振荡10-2管10s，再吸取1ml的10-2管溶液至另一无菌纯化水管（9ml/支）中，记为10-3，在振荡器上振荡10-3管10s，同法操作稀释至10-4管（计数管），上述稀释过程以指示剂质量报告中标示孢子数为6次方为例，为确保稀释管中的溶液混合均匀以获得准确的计数，振荡后要立即移液，沉降的溶液在移液前需要再次振荡。

8）稀释倍数=生物指示剂质量报告中标示孢子数的指数－2，若标示量为2.3×105，则稀释倍数为5－2=3，即稀释至10-3管计数即可。

9）取计数管在振荡器上振荡10s，用移液枪吸取1ml的计数管溶液按检验用菌株稀释及计数标准操作规程的浇注法进行计数确认，计数用培养基为胰酪大豆胨琼脂培养基/胰酪大豆胨琼脂对照培养基，平行制备2块计数平皿，

10）其余BCD管同7）-9）项下操作，ABCD 4支平底试管共计制备8块计数平皿。

11）按《微生物检验用实验室清洁卫生标准操作规程》做完清洁后，人员及物品按照《微生物检验用实验室人物流进出标准操作规程》出室。

12）实验过程填写《生物指示剂孢子含量测定记录（滤纸片类）》及使用设备的相关记录。

5、培养：

将计数平皿（ABCD管各2块，共8块）置于培养箱中，参照生物指示剂质量报告中该菌株孢子要求的培养温度进行培养，除特殊菌株外，一般培养48h计数。

6、计算：

计数平皿均值（修约至个位）=（（A管计数平皿1#+2#）+（B管计数平皿1#+2#）+（C管计数平皿1#+2#）+（D管计数平皿1#+2#））÷8

回收率=计数平皿均值×10稀释倍数（指数中的稀释倍数即4检验步骤的8）项下的稀释倍数）÷生物指示剂标示孢子数×100%