标签：荧光定量 PCR PCR 试剂  实时荧光定量 PCR 耗材 

所谓实时荧光定量 PCR 技术 ，是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程，后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。以下便是天津本生生物就荧光定量 PCR 原理的简要说明，一起来看下：

检测方法：

1.SYBRGreenⅠ法：在 PCR 反应体系中，加入过量 SYBR 荧光染料，SYBR 荧光染料特异性地掺入 DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加*同步。SYBR 定量 PCR 扩增荧光曲线图 PCR 产物熔解曲线图 (单一峰图表明 PCR 扩增产物的单一性)

2.TaqMan 探针法：探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR 扩增时，Taq 酶的 5』-3』外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物的形成*同步。

1. 荧光阈值 (threshold) 的设定 PCR 反应的前 15 个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省 (默认) 设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍，即：threshold = 10*SDcycle 3-152. Ct 值与起始模板的关系每个模板的 Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，公式如下。Ct =-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)n 为扩增反应的循环次数，X0 为初始模板量，Ex 为扩增效率，N 为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。起始拷贝数越多，Ct 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代 Ct 值。因此，只要获得未知样品的 Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

实时荧光定量 PCR 所使用的荧光物质可分为两种：

1. TaqMan 荧光探针：PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR 扩增时，Taq 酶的 5'-3' 外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成*同步。而新型 TaqMan-MGB 探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变 (SNP)，有望成为基因诊断和个体化用药分析的当选技术平台。

2. SYBR 荧光染料：在 PCR 反应体系中，加入过量 SYBR 荧光染料，SYBR 荧光染料非特异性地掺入 DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加*同步。SYBR 仅与双链 DNA 进行结合，因此可以通过溶解曲线，确定 PCR 反应是否特异。

3. 分子信标：是一种在 5 和 3 末端自身形成一个 8 个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，导致荧光基团与淬灭基团紧紧靠近，不会产生荧光。PCR 产物生成后，退火过程中，分子信标中间部分与特定 DNA 序列配对，荧光基因与淬灭基因分离产生荧光 。

1. 传统定量 PCR 方法简介：

1) 内参照法：在不同的 PCR 反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在 PCR 产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。

2) 竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增 (其中一个引物为荧光标记)。扩增后用内切酶消化 PCR 产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。3)PCR-ELISA 法：利用 digaoxin 或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗 digaoxin 或生物素酶标抗体-辣根过氧化物酶结合物，终酶使底物显色。常规的 PCR-ELISA 法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。

2. 内标在传统定量中的作用由于传统定量方法都是终点检测，即 PCR 到达平台期后进行检测，而 PCR 经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在 96 孔 PCR 仪上做 96 次重复实验，所得结果有很大差异，因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。

3. 内标对定量 PCR 的影响若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则 PCR 反应变为双重 PCR，双重 PCR 反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。 实时荧光定量 PCR 技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品 Ct 值的计算，根据标准曲线获得定量结果。

因此，实时荧光定量 PCR 无需内标是建立在两个基础之上的：

1)Ct 值的重现性 PCR 循环在到达 Ct 值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期 (对数期)，此时微小误差尚未放大，因此 Ct 值的重现性*，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的 Ct 值是恒定的。

2)Ct 值与起始模板的线性关系由于 Ct 值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量 PCR 是一种采用外标准曲线定量的方法。外标准曲线的定量方法相比内标法是一种准确的、值得信赖的科学方法。利用外标准曲线的实时荧光定量 PCR 是迄今为止定量准确，重现性的定量方法，已得到*的*，广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。 各级各类医疗机构、大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。由于 qPCR 是实时定量检测致病病原体基因核酸，因此它比化学发光、时间分辨、蛋白芯片等免疫学方法更具独到优 

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