ELISA实验结果不理想、应注意哪些要点

　　优化ELISA的重点之一在于洗涤。洗涤步骤可降低未结合抗体所引起的背景信号，从而增加分析的信噪比。每一步之间的洗涤确保只有特异的结合事件被保留，在最后一步产生信号。而不充分的洗涤会导致差异和高背景，从而带来不理想的结果。

　　在做ELISA实验时，洗板有两种方法：手工法洗板 和 洗板机洗板。二者没有本质的差别，只要操作合乎要求，均能得到正确、可靠的结果。

　　手工洗板：

　　手工洗板人为因素比较大，实验人员必须经验丰富，洗涤次数要足够，冲击力又不要太大，加入的洗液量以说明书为准，防止孔口内有游离酶未能洗净，同时防止孔与孔之间液体交叉。洗涤结束后扣干亦非常重要，否则易造成假阳性。每次洗完板后，在吸水纸上轻轻拍干，拍板时要垂直，避免交叉感染。用力不能过猛，防止抗原抗体复合物脱离;吸水纸要一次性使用，应使用不易脱落碎屑的吸水纸为宜。酶结合物不耐干燥，特别在较高的温度下更易失活，所以拍干的反应板应尽量缩短在空气中暴露的时间，时间越长，吸光度值越低。

　　手工操作有 浸泡式 和 流水冲洗式 两种方法：

　　浸泡式

　　1. 吸干或甩干孔内反应液;

　　2. 用洗涤液过洗一遍(将洗涤液注满板孔后，即甩去);

　　3. 浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置1～2分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短;

　　4. 吸干孔内液体。吸干应，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干;

　　5. 重复操作步骤3和4，洗涤3～4次(或按说明规定)。在间接法中如本底较高，可增加洗涤次数或延长浸泡时间。

　　微量滴定板多采用浸泡式洗涤法。洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。

　　洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20，其浓度可在0.05%～0.2%之间，高于0.2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。

　　流水冲洗式

　　流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤，洗涤液仅为蒸馏水甚至可用自来水。洗涤时附接一特殊装置，使小珠在流水冲击下不断地滚动淋洗，持续冲洗2分钟后，吸干液体，再用蒸馏水浸泡2分钟，吸干即可。浸泡式犹如盆浴，流水冲洗式则好比淋浴，其洗涤效果更为，且也简便、快速。

　　已有实验表明，流水冲洗式同样也适用于微量滴定板的洗涤。洗涤时设法加大水流量或加大水压，让水流冲击板孔表面，洗涤效果更佳。

　　洗板机洗板：

　　洗板机洗板人为因素少，速度快，条件恒定，但是使用洗板机洗板时应注意以下三个关键点。

　　洗涤参数

　　主要的参数是洗涤量。自动洗板机会分配洗涤液。如果你之前遭遇过高背景，那么不要犹豫，将洗涤量调为高，最好是比包被体积更高。太少的洗涤液会让一部分分析表面洗涤不到，从而明显增加背景。所有反应孔的洗涤量必须相同。

　　ELISA试剂盒的使用手册中有列出洗涤量。我们建议使用350µl洗涤液进行洗涤，以便清洁整个反应孔的壁。一般来说，洗涤量越高，则孵育步骤残留的抗体或抗原量就越少。

　　洗涤次数

　　影响洗涤效果的主要参数是洗涤循环的量。当然，洗涤次数越多，背景越低。然而，太多次的洗涤会降低信号强度，使其难以测定。通常的做法是在每次抗体或抗原孵育后重复洗涤三次。不过，一般而言，包被平板需要的洗涤次数比用户包被的平板要少。对于用户包被的ELISA板，必须优化洗涤次数。

　　控制洗涤量和洗涤次数的另一种方法是加入过量的洗涤液。一般来说，96孔板的每个孔能容纳330至460 µl。不过，有些自动化洗板机可设置程序，分配远远超出这个量的洗涤液，比如1 ml。它是如何做到的呢?其实很简单，就是在分液的同时打开吸液功能。换句话说，随着分液器分配更多的液体，抽吸器也将液体吸出。这种技术能增加洗涤量，但不会溢出到其他孔中。

　　抽 吸

　　还有一些参数会影响洗涤步骤的效果。这些参数包括吸液高度和吸入位置，这两者都能调整，以降低背景(残留量)和差异。

　　残留液体中包含未结合的抗原或抗体，它们会增加背景信号。残留量越小，残留液体越少，转移到下一步的干扰液体也就越少。

　　吸液高度会明显影响残留量;如果洗涤吸头与反应孔底部的距离稍大，那就会让残留量急剧增加。反之，如果洗涤吸头压着反应孔底部，那么也会使吸液效率降低，残留量增加。

　　目前的洗板机一般使用两种类型的洗头：刚性和浮动。浮动洗头中的吸头可在洗涤过程中自由上下移动，而刚性洗头则固定在适当的位置。使用刚性洗头的洗涤操作在优化起来更为复杂，因为你需要非常仔细地调整吸液高度。如果你们实验室使用几种不同的板，那可能会很耗时。在使用浮动洗头时，吸头会降到反应孔的底部。调整高度就不是很重要，因此洗头会下降到底部。

　　抽吸的位置也对残留量有着重要影响;如果每个孔只使用一个抽吸点(这很常见，因为更快)，那么抽吸的位置需要优化。最佳的位置取决于洗头的性状，但它几乎不在反应孔的中间，即使这是所有洗头最常见的默认位置。一般来说，最佳位置在孔中间与孔壁之间的某处。

　　反应孔的形状也会影响残留量。C形底(平底圆角)的微孔板一般会比那些平底尖角的微孔板残留量更低。

　　洗板时注意事项：

　　1. 需每天校正注液量及残液量，洗涤后残液量不得大于2 μl。

　　2. 及时更换破损吸液针，避免破坏底板包被。

　　3. 针对不同厂家酶标板注意调整吸液头下降高度，避免冲洗针头卡住酶标板。

　　4. 注意调整洗液量，洗液量过多将溢出，过少将达不到洗涤效果。

　　5. 关机前使用蒸馏水冲洗管道，避免洗液的结晶物堵塞管道。

　　4. 不同种试剂盒的洗液严禁混合使用。

　　为了洗涤效果较好，实验室可采用机器与人工洗涤相结合的方法，在机器洗涤后再进行人工洗板1～2次，能达到理想的洗涤效果。ELISA看起来很简单，但是在实际操作过程中，绝不能掉以轻心，除了严谨规范的实验操作，高品质的试剂盒与专业的技术团队也是获得准确结果的保证!

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