超纯水在PCR检测中的作用

今天带大家走入核酸检测的常用方法PCR方法，以及如何在PCR检测过程中降低检测结果假阴性概率。

一、什么是PCR技术?

PCR技术又称为聚合酶链式反应。是一种用于放大扩增特定的DNA的片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的大特点是能将微量的DNA大幅增加。

在病毒检测中，核酸检测被定义为临床诊断的金标准，RT-PCR技术被反复提到，它是一种将RNA反转录和PCR相结合的技术。首先在反转录酶.的作用下，将提取到的RNA合成cDNA,再以cDNA为模板，在DNA聚合酶作用下不断扩增(变性-退火-延伸多个循环)合成目的片段并进行分析。

二、PCR用水

PCR技术目前多搭配试剂盒使用，也有用户自行制备反应体系，无论哪个过程都需要使用水。无论是近年来季节性爆发的甲流乙流，还是目前都在经历的病毒，在检测过程中都涉及一个痛点，那就是如何尽可能提高核酸检测的准确性，减少假.阴性结果出现的可能性。

我们首先分析一下假阴性结果出现的原因，以病毒核酸检测为例，假阴性的主要原因有:

1病人病程:不同病程，患者体内病毒载量不同;

2采样部位:咽拭子、鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等不同采样部位病毒载量均不同;

3采样准确性:拭子质量，工作人员操作等;

4试剂盒的质量:引物设计以及水质控制。

为了顺利将提取到的RNA反转录并实现DNA的成功扩增，必须抑制核糖核酸酶(RNases)的降解作用，如果试剂盒用水内含RNases，将极有可能导致假阴性结果的出现。

三、去除RNases的主要方法

1高压灭菌:即便是在180°C下高压灭菌4h之后，RNases仍保持某些活性，且某些细菌失活会释放更多的RNases;

2 DEPC法(二乙基焦碳酸酯处理法) :利用二乙基焦碳酸酯(DEPC) 处理方法使酶失活是用来抑制水溶液中RNases活性的常见方法。然而，二乙基焦碳酸酯是一种可疑致癌物，处理须小心;同时该方法虽然能够使酶失活，却无法将其从水中去除，同时清除多余的DEPC过程中，会产生乙醇，二氧化碳等其他污染物;

3超滤法:超滤是一种真正能够从水溶液中清除RNases的方法。

四、超滤膜介绍

超滤膜被大量用于水处理工程。超滤技术在反渗透预处理、饮用水处理、中水回用等领域发挥着越来越重要的作用。超滤技术在酒类和饮料的除菌与除浊，药品的除热原以及食品及制药物浓缩过程中均起到关键作用。

超滤过滤孔径和截留分子量的范围一直以来定义较为模糊，一般认为超滤膜的过滤孔径为0.001-0.1微米，截留分子量(Molecular weigh cut-off, MWCO)为1,000-1,000,000 Dalton。严格意义上来说超滤膜的过滤孔径为0.001-0.01微米，截留分子量为1,000-300,000 Dalton。若过滤孔径大于0.01微米，或截留分子量大于300,000 Dalton的微孔膜就应该定义为微滤膜或精滤膜。

一般用于水处理的超滤膜标称截留分子量为30,000-300,000 Dalton，而截留分子量为6,000-30,000 Dalton 的超滤膜大多用于物料的分离、浓缩、除菌和除热源等领域。

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