人NK细胞培养基（套装）

人NK细胞无血清无动物成分培养基操作说明

【实验材料】

1. KXAcF扩增液（1L，货号：kx40-202）

2. 激活剂浓缩液（0.5ml，货号：kx40-201）

3. 重组人白介素-2

4. 重组人白介素-15

5. 细胞培养瓶

6. 细胞培养袋

7. 人淋巴细胞分离液（Ficoll-Hypaque，比重1.077g/ml）

8. 生理盐水或PBS（PH 7.2）

9. 注射器及其它细胞培养用材料

【操作方法】

1. 激活剂预处理

  推荐的处理方案

注意：一般而言，脐血单个核细胞浓度是外周血的一倍左右。

      通常使用的脐血采集袋中含抗凝剂 28ml/袋

1. 吸取激活剂75ul，加至1个25cm²培养瓶中。加入PBS 5ml充分混匀，使液体分散在瓶底。
2. 吸取激活剂250ul，加至1个75cm²培养瓶中。加入PBS 10ml充分混匀，使液体分散在瓶底。
3. 或吸取激活剂500ul，加至1个175cm²培养瓶中。加入PBS 20ml充分混匀，使液体分散在瓶底。
4. 或吸取激活剂1ml，加至1个250cm²培养瓶中。加入PBS 40ml充分混匀，使液体分散在瓶底。

注：饱和浓度的激活剂利于NK细胞的特异性活化。

1. 4℃活化过夜；或置于4℃冰箱保存，可储存2周。
2. 吸除激活剂，沿培养瓶侧壁加入生理盐水，轻轻晃动培养瓶，使液体充分分散。特别强调：侧壁加入生理盐水。
3. 吸除生理盐水，洗涤后的培养瓶应立即使用。

提示：

• 使用PBS稀释激活剂，可维持激活剂工作液的PH值，从而保证抗体与培养瓶底的充分结合
• 必要时，可在37℃条件下反应至少1小时，但效果较差，常影响终NK细胞比例。增加激活剂活化时间，常可达到较好的效果。

2. 外周血采集

准备材料：50ml注射器，注射用肝素钠溶液（2ml，12500U）

操作步骤：

1. 50ml注射器连接静脉输液针，去除输液针保护套，抽取肝素钠1ml浸润管壁，推出残留液体。
2. 肘静脉处皮肤消毒，抽取30-50ml外周血。
3. 套上输液针保护套，在针头近端将软管打结封闭静脉输液针。
4. 核对姓名的信息，标记。
5. 一次性铺巾包裹注射器，至于血液标本采集箱，室温运输。
6. 3小时内交给实验室技术人员。

3. 脐带静脉血采集

按照脐静脉血采集常规，使用血液采集袋采集。

4. 单个核细胞分离、血浆采集及处理

1. 开启水浴箱，调整温度至56℃以备灭活补体。
2. 采集常规外周血、脐带血或G-CSF动员的外周血。
3. 离心，500g，10分钟，收集血浆。56℃，20-30分钟灭活补体。
4. 稀释血细胞，Ficoll-Hypaque密度梯度离心，800g（2000rpm左右），30分钟。
5. 在收集单个核细胞层之前，将血浆离心，800g，5分钟以上，以去除其中的血小板。
6. 收取单个核细胞层，充分混匀。离心洗涤，500g，6-10分钟（根据液体量调整）。
7. 再次离心洗涤，500g，6-10分钟（根据液体量调整）。
8. 用KXAcF扩增液悬浮细胞。
9. 取10ul细胞悬浮液，加入白细胞稀释液90ul，或3%冰醋酸90ul，混匀后计细胞数。

5. 细胞培养

1)  单个核细胞悬液中加入IL-2，500-1000U/ml，IL-15，25-50ng/ml，自体血浆5-10%。细胞浓度调整至2*10⁶/ml，

A：细胞初始接种浓度是影响终NK细胞比例及细胞扩增倍数的关键因素之一。根据经验，细胞终浓度2*10⁶/ml为宜。

B：某些外周血，血浆十分浑浊，其中的脂类含量过高，不利于细胞增殖。可换用混合人AB血浆。

2)  将细胞悬液加入已经预铺板、且已经洗涤一次的培养瓶中，37℃，5%CO2和100%湿度下培养。次日，观察是否有污染现象；如无，继续培养，无需反复观察。

3)  72小时后，根据细胞密度，加入适量IL-2，500-1000U/ml，IL-15，25-50ng/ml，自体血浆10%的扩增培养基。一般情况下，补充液体量为原体积的一倍。IL-2和IL-15按照补液后的总体积计算，血浆按照新培养基体积计算。

4)  继续培养2天，培养液中补充适量含血浆5-10%，IL-2（500-1000U/ml）和IL-15（25-50ng/ml）的新鲜扩增培养基。补液量一般为原体积的一倍。

5)  之后，每天观察细胞集落大小及密度，及时补充含血浆、IL-2和IL-15的新鲜培养基。

提示：

A：早期细胞增殖速度较慢，这与NK细胞的特异性活化有关。一般而言，NK细胞占外周血淋巴细胞的比例为5-15%，NK细胞扩增一倍，细胞总数只扩增1.2倍。因此，早期细胞总数并不能反映细胞扩增速度。

B：转大瓶或转袋培养是NK细胞培养的关键步骤之一。经过72小时培养后，部分NK细胞形成贴壁的集落；而且，这些贴壁的集落常分布于培养瓶底的边沿。如经5-6次吹打后，NK细胞集落未脱落，则在原培养瓶中加入含5-10%血浆、IL-2（500-1000U/ml）和IL-15（25-50ng/ml）的新鲜扩增培养基继续培养2-3天，则大部分集落可自行脱落。收集这些细胞，与其他细胞转入大培养袋或大培养瓶中混合培养即可。

 附图1.实际直径接近或超过250um的NK细胞集落，集落贴壁生长。

      尺寸：100um。

6）继续培养，直至细胞总体积超过200ml，细胞数超过2x10⁸个。此时，可转大培养袋培养，培养体积扩大一倍。新鲜扩增培养基中含IL-2（500-1000U/ml）和IL-15（25-50ng/ml）补充自体血浆。

7）每隔2-3天补充含新鲜的血浆及细胞因子的培养基，培养12-15天细胞，达到目的用量后，可进行质量检验，之后收获细胞。

提示：

A．每次补液时，均添加IL-15可提高NK细胞比例，但也增加了培养成本。

B．如在培养后期无自体血浆可用，可补充人AB血浆，但是需要灭活补体。

C．对于1.8L培养袋而言，如400ml培养基平铺整个培养袋，则不能维系细胞间相互支持作用。建议折叠一半培养袋，使培养基集聚于另一半。依据经验，这样可更好的维系细胞的快速增殖。

6. 细胞收获

1）将细胞转移至离心管，计细胞数及细胞活力。

2）将细胞转移至250ml离心管，离心收获细胞，离心速度为1500rpm (500xg)，离心时间为10分钟。

3）将细胞转移至50ml离心管，生理盐水悬浮，离心洗涤2次，1500rpm (500xg)，6分钟。

4）用含1%注射用人白蛋白的生理盐水悬浮细胞。

5）70μm细胞筛过滤细胞。

1. 留小样备质检。
2. 将细胞转移至输液袋中。静置于室温。

7. 注意事项

1）初始接种单个核细胞的浓度以及细胞的活性，不但影响终细胞群NK细胞比例，也影响培养过程中细胞的活性。过低的单个核细胞接种浓度，细胞增殖速度慢；过高的浓度，终细胞群中NK细胞比例低。

2）在小培养袋或大培养瓶中培养，总体积200ml，细胞总数在2*10⁸以上时，方可转入大培养袋。否则，细胞增殖速度慢，终细胞总数低。

3）体系中持续添加IL-15，可维系NK细胞优势扩增。

4）NK细胞增殖速度个体差异很大，转大瓶或转袋培养后，应密切观察细胞生长状态。由于NK细胞常呈集落形式增殖，细胞计数准确不高。建议根据培养基颜色（由红色变橙色），每10x10视野中实际直径接近或大于250um的集落平均达到3-5个，即应补加新鲜的扩增培养基。同样，培养基中应添加适量血浆、IL-2和IL-15.

附图2.培养基颜色和集落大小，是决定换液及换液量的关键因素。左图：左侧为刚补液的培养基颜色，右侧为需要补液的液体颜色。右图：a和b:大集落；c和d:小集落。