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利用新型成像细胞仪直接测定干细胞的浓度、活力和表型

摘要：间充质干细胞是多能干细胞的一个子集，可以从中胚层中分离出来。它们具有自我复制更新和多向分化的特点，在医学上的各种治疗中具有很高的潜力。间充质干细胞具有特的免疫表型和免疫调节能力。因此，间充质干细胞已经广泛应用于干细胞移植、组织工程和器移植。除了这些应用之外，它们在一系列基础和临床研究实验中作为种子细胞被用作组织工程的理想工具。到目前为止，还没有一个广泛接受的方法和标准来控制间充质干细胞的质量。Countstar Rigel可以监测这些干细胞生产和分化过程中的浓度、活力和表型特征（及其变化）。Countstar Rigel还具有在细胞质量监测的整个过程中通过久明场和基于荧光的图像记录获得额外形态信息的优势。Countstar Rigel为干细胞的质量控制提供了一种快速、复杂和可靠的方法。

材料和方法：

齐念敏教授用AO/PI染色液（上海瑞宇，CF002）对脂肪源性间充质干细胞（AdMSCs）进行了研究。抗体：CD29，CD34，CD45，CD56，CD73，CD105，HLADR（BD公司）。

AdMSCs在37℃、5%CO2湿化培养箱中培养。使用前用胰蛋酶消化。

按照CD标记染色程序作为抗体的手册。

使用Countstar Rigel检测CD标记：

1.通过设置PE通道以对PE荧光成像来创建信号颜色应用程序。

2.从每个腔室捕获3个场。

3.成像和初步分析完成后，通过FCS软件设置阳性和阴性转染的阈值（对数门）设置。

干细胞的质量控制

下图（图1）显示了干细胞治疗的程序。

图1：干细胞治疗程序

结果：

测定AdMSCs的浓度、活力、直径和聚集性。

通过AO/PI测定AdMSCs的活力。通过设置绿色通道和红色通道对AO和PI荧光以及亮场进行成像，创建了双色应用程序。示例图像如图2所示。

图2:AdMSC运输前和运输后的图像。A.运输前；示出了代表性图像。B.运输后；示出了代表性图像。

与运输前相比，运输后AdMSC的生存能力发生了巨大变化。运输前的存活率为92%，但运输后降至71%。结果如图3所示。

图3。AdMSC的生存能力结果（运输前和运输后）

直径和聚集度也由计数星Rigel测定。与运输前相比，运输后AdMSC的直径发生了显著变化。运输前直径为19µm，但运输后直径增加到21µm。运输前的总和为20%，但运输后增加到25%。从Countstar Rigel拍摄的图像来看，AdMSC的表型在运输后发生了巨大变化。结果如图4所示。

图4：直径和聚集结果。A： AdMSC的代表性图像、AdMSC的表型在运输后发生了显著变化。B： 运输前的聚集率为20%，但运输后增加到25%。C： 运输前直径为19µm，但运输后直径增加到21µm。

Countstar Rigel测定AdMSCs的免疫表型

用Countstar Rigel法测定AdMSCs的免疫表型，将AdMSCs分别与不同的抗体（CD29、CD34、CD45、CD56、CD73、CD105、HLA-DR）孵育。通过设置绿色通道对PE荧光和亮场进行成像，创建了信号颜色应用程序。应用亮场图片参考分割作为掩模来对PE荧光信号进行采样。CD105的结果如图所示（图5）。

图5:AdMSCs的CD105结果由Countstar Rigel测定。A： FCS express 5 plus软件对不同样本中CD105阳性率的定量分析。B： 高质量的图像提供了额外的形态学信息。C： FCS软件工具通过每个细胞的缩略图验证结果，根据细胞不同的蛋白质表达将细胞分为不同的组。

其他抗体结果如图6所示

图6:A：具有典型纺锤形形态的ASCs的代表性图像。通过奥林巴斯显微镜拍摄。原始放大倍数，（10倍）。B： 钌红染色显示矿化区域，证明了ASCs的脂肪分化。通过奥林巴斯显微镜拍摄。原始放大倍数（10倍）。C： ASCs的Countstar FL特征。

摘要：

Countstar FL可以监测这些干细胞生产和分化过程中的浓度、活力和表型特征（及其变化）。FCS express提供了审查每个信号单元、通过图像验证数据的功能。用户也可以有信心根据Countstar Rigel的结果进行下一个实验。Countstar Rigel为干细胞的质量控制提供了一种快速、复杂和可靠的方法。

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