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我应该使用哪种药物选择标记？

VectorBuilder在其载体上提供了多种药物选择标记，如嘌呤霉素（Puro）、新素（Neo）、潮霉素B（Hygro）和blasticin（Bsd）。总的来说，我们发现嘌呤霉素比其他抗生素更快、更稳定地杀死非耐药细胞。因此，我们建议大多数细胞类型使用Puro。然而，一些细胞类型可能在没有耐药性基因的情况下自然对某些抗生素具有一定程度的耐药性，或者即使有耐药性基因，它们也对某些抗生素敏感。这些细胞需要测试不同的药物选择标记物，以找到最佳的标记物。

常用药物的推荐浓度和选择时间

抗生素细胞系推荐浓度推荐持续时间

嘌呤霉素293T 1-2微克/毫升3-5天

Geneticin（G418）HT1080 500-1000 ug/ml 7-11天

Blasticidin 293T 5-15 ug/ml 7-11天

潮霉素B 293T 100-200微克/毫升5-7天

我们的VectorAcademy文章《增强培养：如何改善细菌生长》为优化抗生素浓度以及其他培养条件以提高质粒产量提供了指南。

笔记

a.使用Geneticin（G418）来选择表达新素抗性基因的细胞。

b.频繁地使细胞传代可以加速杀细胞素的选择。

阅读更多关于我们的药物选择标记物集合的信息

流行的ORF

VectorBuilder提供了许多流行的矢量组件，用户在设计矢量时可以从中进行选择。下表提供了有关这些流行组件的详细信息，这些组件按类别单独列出。

名称描述应用程序说明参考序列

大肠杆菌β-半乳糖苷酶的ORF_Stuffer氨基酸2-83可用作阴性ORF对照。由VectorBuilder设计

荧光记者

名称描述应用说明颜色结构最大激发（nm）最大发射（nm）亮度（EGFP的%）参考序列

EGFP增强型绿色荧光蛋白；基于野生型GFP变体优化的密码子，该变体来自水母维多利亚绿锥虫常用的绿色荧光蛋白；在所有荧光蛋白中亮度、光稳定性和pH稳定性都很高。绿色单体（可形成弱二聚体）484 507 100核酸研究24:4592（1996）

NLS-EGFP-EGFP具有核定位信号的两端核定位。绿色单体（可能形成弱二聚体）484 507 100由VectorBuilder设计

sfGFP来自维多利亚绿锥虫的超级折叠绿色荧光蛋白；GFP变体S30R、Y39N、N105T、Y145F、I171V和A20

我什么时候应该使用荧光蛋白、萤光素酶或LacZ？

荧光蛋白、荧光素酶和LacZ都是基于重组蛋白的报告子，可用于定位或成像研究。然而，这些系统在几个重要方面有所不同，这决定了它们适用于不同的实验设计。

荧光蛋白和萤光素酶都是发光的蛋白质类型，然后可以用相机或类似设备检测到。荧光蛋白的功能是吸收一种颜色的光（激发），然后发射不同颜色的低能量光（发射）。相反，萤光素酶（和其他生物发光酶）通过催化底物（即萤光素）被氧化的化学反应来产生光，并作为反应产物发射光子。

荧光蛋白比萤光素酶亮得多，萤光素酶有利于许多类型的实验，但在组织样本或活体动物中，背景、自发荧光和光散射

我应该使用哪种荧光蛋白？

多年来已经开发了许多荧光蛋白，在实验中使用哪种荧光蛋白取决于许多因素。

单色实验

对于单色实验，绿色FPs是最常见的选择。EGFP是受欢迎的绿色FP，是许多单色研究的好选择。然而，其他绿色FP，如TurboGFP（又名maxGFP），可能是某些应用的更好选择。例如，与EGFP相比，TurboGFP具有许多更先进的功能，如更亮的绿色荧光、更快的成熟、高pH和光稳定性，使其成为受益于早期信号检测和高灵敏度的实验的理想选择。如果首红色FP，mCherry由于其单体结构、良好的荧光性能和低毒性，是大多数实验的佳选择。它特别适用于蛋白质标记或当细胞对可能发生的毒性或蛋白质聚集敏感时

多色实验

对于同时使用多个荧光团（包括FP和DAPI等其他染料）的多色实验，研究人员必须仔细考虑荧光团的光谱特性，以确保基于可用显微镜、流式细胞仪或荧光检测中使用的其他硬件上的激发和/或发射滤光片，荧光团在光谱上是可区分的。基本上，检测硬件应该能够在不受其他荧光团干扰的情况下从实验中使用的多个荧光团中的每一个读出荧光信号。这可以通过使用激发滤波器（或激光器）来产生仅激发感兴趣的荧光团的适当频率的激发光来实现。也可以通过使用发射滤波器仅允许来自感兴趣的荧光团的发射荧光进入检测器来实现。对于两种颜色，标准的绿色FP（如EGFP）加上标准的红色FP（如mCherr）

荧光共振能量转移（FRET）

FPs广泛应用于许多基于荧光共振能量转移（FRET）的应用中。FRET是一个物理过程，在此过程中，激发的供体发色团分子通过非放射性偶极-偶极耦合将能量转移到受体发色团。在观察中，FRET导致供体荧光的减少和受体发射的增加。FRET有几个先决条件：供体和受体必须非常接近（10-100Å）；受体的激发光谱必须与供体的发射光谱重叠；供体和受体的跃迁偶极取向必须平行。FRET依赖于距离，并且FRET的效率与供体和受体之间的距离的六次方成反比。因此，它对距离的微小变化非常敏感，使其成为许多应用中的强大工具，例如研究DNA或蛋白质结构，并进行投资

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