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抗生素问题

建议和解决方案

增加甘油原液的接种量通常可以获得更好的质粒产量。

质粒上复制的起源可能固有不同类型的拷贝数。VectorBuilder生产的一些质粒载体是中拷贝或低拷贝型，因此它们的质粒在大肠杆菌中的复制频率低于高拷贝质粒剂量。为了制备低拷贝质粒，增加用于制备的大肠杆菌培养物的量，以获得令人满意的DNA产量。

在大肠杆菌培养中正确使用抗生素对于获得高质粒产量至关重要。首先，请仔细阅读甘油储备管上的标签，并确保你使用的是与质粒上的抗生素耐药性基因相对应的抗菌药物。滥用抗生素会抑制细菌繁殖。其次，一些抗生素，如氨苄青素，在液体培养中降解快。因此，不含质粒的细菌可以繁殖到培养物的很大一部分，导致质粒制剂的产量很低。为了避免这种情况，请在使用前新鲜制备含有氨西林的生长培养基，并确保提供足够的氨西林。此外，当培养氨西林抗性细菌时，不要让液体培养物在收获前很长时间饱和。

EndA'应变

EndA*菌株保留了表达EndA核酸内切酶的能力，这会导致质粒制备产品中的质粒DNA降解。要去除核酸内切酶，请在DNA清除步骤中对质粒制备柱进行额外清洗，或者最好使用EndA菌株进行克隆

微生物污染

如果你需要在没有抗生素的环境中培养大肠杆菌，请非常小心，以免发生微生物污染。没有转化质粒的微生物往往会更快地繁殖，并在细菌培养中占据主导地位，因为质粒复制会消耗细胞分裂的能量。如果污染已经发生，请用75%的乙醇清洁您的工作台和轨道摇瓶。确保您的培养瓶和移液管端经过良好消毒。你还需要用某些抗生素在琼脂平板上筛选正确的菌株菌落。

噬菌体污染

噬菌体污染可能导致细菌培养中的细胞裂解。如果发生噬菌体污染，立即扔掉受污染的培养物，丢弃所有用于制备细菌培养物的溶液。用0.05%氢氧化钠溶液仔细清洁工作台表面和轨道振荡器。所有用于细菌繁殖的培养瓶也应通过浸泡法用氢氧化钠溶液清洗，然后进行高压灭菌。同样地具有fhuA突变的大肠杆菌菌株，如VB UitraStable“”化学感受态细胞，优选用于克隆，因为它们对T1噬菌体表现出抗性。

序列对齐

确定两个序列彼此之间的相似或不同程度是推断两个序列之间的结构、功能或进化关系的常用方法。VectorBuilder的序列比对工具不仅可以在DNA或蛋白质水平上直接比较两个序列，还可以基于翻译比较两个DNA序列。

比对提供了整个序列的同一性/相似性百分比的全局视角，以及比较单个核苷酸/氨基酸的重点视角。该工具利用间隙和间隙惩罚来最大限度地提高匹配两个核苷酸或氨基酸的机会，同时保持数据的完整性。虽然间隙说明了对齐序列中的插入或删除，但间隙惩罚根据间隙的频率和长度为对齐分配负分数。

GC内容计算器

DNA模板的GC含量是决定将靶基因成功克隆到所需主链中的关键因素。具有高GC含量的基因模板通常导致形成自二聚体或二级结构的更高机会，并且需要更高的退火温度。

该工具允许您确定整个基因序列以及基因内特定区域的GC含量。当输入DNA或RNA序列时，计算每个碱基类型的数量和百分比。通过调整窗口大小，可以在图形读出中可视化序列中较小或较大片段的GC内容。

DNA二级结构

预测由转录的DNA形成的二级结构在各种分子生物学技术中很重要，包括siRNA设计和克隆优化。将您的序列粘贴到下面，并接收预测的二级结构的图形输出。自由能最小化用于确定碱基对之间的相互作用，突出潜在的茎和环的形成。

RNA二级结构的形成

我们可以根据不同的组织水平来检查细胞成分的活性。核酸或蛋白质的一级结构分别是核苷酸或氨基酸的基本序列。DNA的主要结构是ATGC序列的列表。基于附近组分之间的相互作用，分子将形成其稳定、低自由能的构象。对于DNA来说，这种二级结构是由两条互补核苷酸的长链相互缠绕形成双螺旋的结果。这两个股线及其所得的二级结构具有高水平的稳定性。

然而，一旦被转录，RNA就会形成单链核苷酸。这种形式不太稳定，核苷酸将寻求与互补核苷酸形成氢键：A与U，C与G，G与U。如果没有像DNA中发现的互补链，单个RNA链将自身折叠成较低的

图1。单链信使核糖核酸可以自我折叠形成二级结构。

形成的二级结构对RNA的功能有很大影响，无论是编码还是非编码，RNA结构在基因功能和调控中都起着重要作用。确定这种结构可以极大地帮助实验设计和故障排除。我们的二级结构工具提供了RNA链低自由能构象的图形布局。

用户说明：甘油原液

检索矢量信息

你的向量有一个未染色的向量lD，打印在甘油储存管上。您可以通过VectorBullders主页wectorbullder上的“Reteve Veccior informatlon”链接，使用thls lD来检索矢量图、矢量序列和矢量组件公告。

存储

在温和的温度下，混合物以E，coll甘油原液（15%甘油）的形式存在。我们强烈建议您在冷冻vlal之前接种Le llquld培养基。在打开管子之前，请先做一次快速旋转，以从ld中取出reslual llould，避免交叉污染。

arig

甘油原液可放入-80℃中长期保存。我们还建议您单独制作甘油库存作为备用。甘油散装物应仅放置在4’c短期储存（2周）中。

接种

甘油原液来自单个克隆。你可以用它直接接种LB培养基。然而，在某些情况下，这种方法可能导致液体培养物的DNA yfeld较低。如果你连E，这个问题通常会消失。首先将菌落放在平板上，当菌落全新鲜时，用一个菌落接种液体培养物。如果DNA含量低，请重新转化，并克隆一个菌落接种新的lB菌株。如果你在后续工作中使用从原始甘油库中提取的芥子菌集落，那么这个集落相对于母体库获得突变的可能性很小。因此，我们建议您在进行进一步的实验之前，通过测序和限制性内切酶来评估菌落（或几个菌落）的正确性。

要从未冷冻的糖霜中接种，请将一微滤器的糖霜轻轻地滴入补充有适当抗洗剂的混合液中。如果是从冷冻的甘油原液中接种的，用一个sterle plpette端刮下一小块冷冻原液，然后小心地将端扔到llquld Le medlum中。你也可以先在LB平板上划线，然后选择一个菌落接种LB液体。

一些载体，特别是那些大小较大、序列重复或Gc含量异常的载体，可能有发生重排（如缺失）的趋势。减少这种可能性的一种方法是在30℃的平板上培养大肠杆菌，并在培养基中代替标准的37℃。

抗生素浓度

打印在甘油储备管上的载体ls的antblotic restance。请使用LB板或lg培养基中的抗菌剂，浓度如下。

Amplcllin:100μg/ml卡那素:50μg/ml

氯素：34微克/毫升

四环素：5微克/毫升

steptomycin:50ugiml

庆大素：10 pgiml

宿主菌株

请注意甘油储备管上打印的大肠杆菌宿主菌株信息。大多数载体是在Stbl3宿主中构建的，以确保序列的稳定性。某些应用程序需要使用其他主机。例如，来自pET载体的重组蛋白表达通常需要携带T7 RNA聚合酶基因的大肠杆菌宿主，如BL21（DE3），在这种情况下，来自Stbl3宿主的载体需要再转化到合适的宿主中。

特别通知

VectorBuilder为我们构建的载体提供序列保证。如果您决定进行独立验证，强烈建议使用Sanger测序，这是金标准分析。如果出现下一次操作测序（NGS或Nanopore seauencina）所称的测序错误，请在联系我们获得售后支持之前仔细检查buSanger测序的结果。我们最近注意到，在许多情况下，Nanopore测序的错误率很高。

疑难解答：质粒DNA产量低

可能的原因

接种物太小

质粒的拷贝数各不相同

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