U937-LUC人白血病细胞-荧光素酶标记 培养说明

细胞名称   U937-LUC人白血病细胞

组织  U937-LUC人白血病细胞

母细胞来源  客户

转染方法与标记过程的描述 慢病毒转染Hygromycin筛选 

1.质粒部分

1.酶切载体：pGL4.10（luc2）由酶切获得1400bp的luc2基因片断；EGFP和mCherry片段由PCR扩增获得700-800bp左右片段；pSin-hyg-T2A载体酶切线性化。

2.电泳和胶回收：上述酶切产物DNA电泳，TAKARA试剂盒胶回收，回收产物取少量电泳鉴定。

3.连接载体与目的片段:使用Invitrogen T4连接酶连接luc2、EGFP或mCherry片段和pSin-hyg-T2A线性化载体，连接使用20ul体系，25℃，10min。

4.转化：感受态菌One Shot Stbl3在冰上融化后，加入连接产物，静置25min后在水浴42℃，45sec热休克，后加入250ul无抗培养基225转摇菌1h，将转化的菌铺于有氨苄抗性平板37度过夜。

5.挑取单克隆：观察平板后挑取15个单克隆至含2ml氨苄抗性 LB培养基摇菌管中，255转摇菌6.5h。

6.小抽质粒与鉴定：使用碱裂解法小抽，质粒用25ul含RNA酶ddH2O溶解；酶切鉴定: 重组质粒用通过酶切鉴定。

7.荧光素表达鉴定: 重组质粒pSin-hyg-GFP/luc2（以下简称Gluc）或pSin-hyg-mCherry/luc2（以下简称Mluc） 转染293T细胞：DNA定量后，使用PEI转染Gluc或Mluc至24孔板已预铺的293T细胞中。转染采用脂质体法转染，试剂采用JetPEI (Polyplus公司)。两管EP管中分别加入50ul生理盐水，其中一管加入1ug量的质粒（DNA体积=1ug/DNA浓度），轻轻震荡混匀，再轻微离心；在另一管中加入PEI 2ul轻轻震荡混匀，轻微离心，然后把PEI管中的溶液加入含有的质粒管中，室温孵育20min。将脂质体包绕DNA的混合液加入需要转染的24孔内，37 ℃、5 % CO2条件下培养，8小时后换培养液。

8.报告基因检测：Passive Lysis Agent裂解细胞，加入荧光素酶作用底物，将转染质粒的细胞与阴性，阳性对照共同进行单报告基因检测。

9.质粒中抽：取1ml转染报告基因检测正确的菌液加入100ml氨苄抗性的LB培养基中摇菌过夜，使用Invitrogen试剂盒中抽，产物电泳鉴定，－20℃保存。

U937-LUC人白血病细胞-荧光素酶标记 培养说明

1.慢病毒包装部分

1. 质粒共转染细胞：转染前一天，293T在10cm培养盘中的细胞达到90％，胰酶消化后，1：3传入新10cm培养盘中。转染时，细胞在培养盘中密度达到80％。采用脂质体PEI转染法使编码慢病毒包膜蛋白的质粒VSV G, Packaging Mix以及构建的Gluc或Mluc质粒15µg共转染。6h后换新鲜DMEM培养基。

2．提取病毒上清：转染48-72hours后，将含有毒液的培养基转移到15ml离心管中,在低温4摄氏度条件下，3000rpm，离心10min去除片状沉淀的细胞碎片。

3．浓缩病毒：将病毒上清用0.45um滤器过滤至浓缩离心管中，2000rpm，4℃，15min离心。浓缩液收集于500µl离心管中，-80℃保存。

1.慢病毒感染&筛选

1.感染前一天(Day1)，消化4T1细胞并计数，将细胞铺于24孔板中（以便在感染前细胞达到30%-50%的汇合度，37°C过夜孵化细胞。

2.(Day2) 解冻低温保存的慢病毒液，并且制备1：2病毒稀释液200µl加入细胞中。

3.向每孔加入Polybrene达到终浓度6ug/ml，晃匀孔板，37度孵化过夜。

4.(Day3)移去含有慢病毒的培养基，加入500µl*培养基。

5.(Day4)换液，加入300µg/ml  Hygromycin（Sigma）来选择稳定感染的细胞克隆。

6.(Day4－7），每24h换液，300µg/ml Hygromycin（Sigma）来选择稳定感染的细胞克隆。

维持培养。

7.(Day8－12）细胞逐渐由24孔板传入6孔板、6cm盘和10cm盘中100µg/ml Hygromycin维持培养。

8. 4T1-Gluc/Mluc细胞系鉴定: 取5×104细胞，用Passive Lysis裂解液裂解，加入荧光素酶作用底物，将转染质粒的细胞与阴性，阳性对照共同进行单报告基因检测。GFP和mCherry表达通过荧光显微镜观察。

培养条件 ：置于37℃、5％CO2培养箱中，用含10％胎牛血清（FBS;    Hyclone, Tauranga, New Zealand）和1％双抗（100 U/ ml青霉素和100 μg/ ml链霉素，Hyclone, Logan, UT, USA）的高糖DMEM培养基培养，培养一天（密度大概80%）按照1：3的比例传代。

细胞传代所需时间：1天/代 

筛选标记维持压力和选择压力：Hygromycin 100ug/ml 和300ug/ml 。

体外实验数据：

1.4T1-Gluc 和4T1-Mluc荧光显微镜照片(100×)：

2.细胞裂解液的发光值，数据—化学发光仪(Berthold Lumat LB 9501)检测。

A2780/Taxol-Luc，Luciferase萤火虫酶荧光稳定表达细胞株人卵巢癌紫杉醇耐药株-NTCC保藏中心

【Organism物种来源】Animal 

【Tissue组织来源】 

【Cell Type细胞类型】 

【Product Format产品状态】 frozen/live culture

【Morphology细胞形态】 

【Culture Properties细胞特性】 

【Biosafety Level生物安全级别】 1/2

Biosafety classification is based on U.S. Public Health Service Guidelines, it is the responsibility of the customer to ensure that their facilities comply with biosafety regulations for their own country.

【Disease细胞源疾病】

【Age年龄】 

【Gender性别】 Male/Female

【Storage Conditions保存条件】 liquid nitrogen vapor phase

【Karyotype染色体组型】 

【Images细胞图片】 Cell Micrograph

【Derivation衍生细胞】

【Clinical Data临床数据】 

【Comments其他描述】 

【Complete Growth Medium*培养基】 The base medium for this cell line is DMEM/RPMI-1640 Medium. To make the complete growth medium, add the following components to the base medium: fetal bovine serum to a final concentration of 10%. 

【Subculturing传代方法】 

Volumes are given for a 75 cm2 flask. Increase or decrease the amount of dissociation medium needed proportionally for culture vessels of other sizes.

Remove and discard culture medium.

Briefly rinse the cell layer with 0.25% (w/v) Trypsin- 0.53 mM EDTA solution to remove all traces of serum that contains trypsin inhibitor.

Add 2.0 to 3.0 mL of Trypsin-EDTA solution to flask and observe cells under an inverted microscope until cell layer is dispersed (usually within 5 to 15 minutes).

Note: To avoid clumping do not agitate the cells by hitting or shaking the flask while waiting for the cells to detach. Cells that are difficult to detach may be placed at 37°C to facilitate dispersal.

Add 6.0 to 8.0 mL of complete growth medium and aspirate cells by gently pipetting.

Add appropriate aliquots of the cell suspension to new culture vessels.

Incubate cultures at 37°C.

Subc*tion Ratio: A subc*tion ratio of 1:2 to 1:6 is recommended

Medium Renewal: 2 to 3 times per week

【Cryopreservation冻存条件】 

【Freeze Medium冻存培养基】Complete growth medium supplemented with 5% (v/v) DMSO

【Storage Temperature保存温度】 Liquid nitrogen vapor phase

【Culture Conditions培养条件】 

【Atmosphere培养环境】 Air, 95%; carbon dioxide (CO2), 5%

【Temperature培养温度】 37°C

【STR Profile图谱】 

【Population Doubling Time倍增殖时间】

【References参考文献】