上海琛艺实业有限公司经过数年的努力发展已迅速成为集产品研发、生产、经营为一体的专业化生物工程公司。公司新引进细胞上千株，其中人的已通过STR鉴定的有几百株，欢迎各位选购。。。。。。

细胞名称：  NIH-3T3-GFP小鼠成纤维细胞-绿色标记培养步骤

培养条件：DMEM +10% FBS

形       态：贴壁；上皮细胞样

背       景：该细胞源于Osborne-Mendel大鼠的正常肾组织。

NRK(大鼠肾细胞)“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。在一代中，细胞培增3～6次。细胞传代后，一般经过三个阶段：游离期、指数增生期和停止期。常用细胞分裂指数表示细胞增殖的旺盛程度，即细胞群的分裂相数／100个细胞。一般细胞分裂指数介于0.2％～0.5％，肿瘤细胞可达3～5％。接种2～3天分裂增殖旺盛，是活力zui好时期，称指数增生期(对数生长期)，适宜进行各种试验。

formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。还原生成的formazan结晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。也可以用DMSO来溶解。MTT粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。实验的时候一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。

目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由冰晶形成的细胞损伤。
1、10%的DMSO+90%胎牛血清。甘油一般用于菌种保存很少用于细胞冻存。
2、取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中。
3、离心1000 rpm,5 min。
4、去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的zui终密度为5x10^6/ml~1x10^7/ml。
5、 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者。
6、冻存：标准的冻存程序为降温速率-1~-2℃/min；当温度达到-25℃以下时，可增至-5℃~-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。

1.接种：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个接种到96孔板，每孔体积200ul.

2细胞培养：同一般培养条件，培养3－5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。

3.呈色：培养3－5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS 配)20ul.

继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。

NIH-3T3-GFP小鼠成纤维细胞-绿色标记培养步骤

购买上海琛艺细胞注意事项发布
　　一、客户收到细胞先不开盖，放在培养箱静置若干小时后（看细胞密度而定）在倒置显微镜下观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照（建议受收细胞时的培养基拍一张照片，观察培养基的颜色和是否有漏液情况，显微镜下拍细胞100X，200X各一张），排除细胞本身污染的情况；
　　收到细胞未开封，出现污染状况我们负责免费发送一株细胞。
　　二、如为贴壁细胞，请在显微镜下观察细胞密度：
　　1.  未超过80%汇合度时，用75%酒精（建议配置75%酒精的水也是灭菌超纯水，喷洒整个瓶消毒后放到超菌台内，严格无菌操作；然后打开盖子，先用枪头把培养基吸出10ml左右，放在离心管里，然后瓶口过火（严禁直接倾倒），这样可以保证不污染，再用10ml的移液管，将剩余的培液全部吸出，放于离心管中，培养瓶中只剩余10ml左右培液就可以了。培养16hr(时间根据细胞生长情况调整）之后，传代或者冻存。
　　2. 超过80%汇合度时，请按细胞培养条件传代培养。具体步骤如下：
　　1) 弃去培养液，用3ml PBS（不含钙，镁离子）洗1-2次；
　　2) 加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM  EDTA）于T25培养瓶中，倒转放于37度培养箱1-3分钟预热，然后又将培养瓶倒转大约30秒后，在倒置显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆分散，轻敲几下培养培养瓶，细胞随即脱落下来；
　　3) 加入6-8ml*培养基，吸出，分到新的培养瓶中，按要求分瓶。
　　三、如为悬浮细胞，吸出培养液，1000转/分钟离心5分钟，吸出上清，管底细胞用新鲜培养基悬浮细胞后移回培养瓶。
　　注意：换液时一半用我们的培养基，一半用你们的，以免细胞不适应而造成生长不好。