PCR实验室核酸检测具体流程

    近日，北京协和发布了病毒核酸检测标准操作流程的培训视频，供其他符合条件的医疗机构在开展病毒核酸检测时参考。仪器信息网特将其整理成文字版本供大家方便查看。

　一、个人三级防护穿戴

　　带一次性帽子、佩戴医用N95、一次性防护服、一次性鞋套、一次性防水靴套、一层乳胶手套、外层一次性隔离衣、防护目镜、第二层乳胶手套、穿戴完毕后应尽快通过缓冲间或者走廊，进入核酸提取区（业核酸提取实验室）。

　　二、样本灭活处理

　　核酸检测须有两名工作人员快速通过进入实验室，进行灭活实验操作。生物安全柜内需配备吸水棉与消毒酒精、有条件可配备吸水台布，对样本溢洒时进行紧急处理；打开二级容器，用75%酒精消毒物体表面，检测样本管密闭性后进行灭活处理，灭活条件（56℃，30min，恒温样本灭菌仪等多种方式），取出酒精灭活管用酒精擦拭外表，将样本放入到生物安全柜内。

三、手工核酸提取

　　操作人员进入试剂配置区或者单独的洁净实验室。

　　一、试剂区准备

　　根据说明说要求，在AW1中加入无水乙醇130mL，在AW2中加入无水乙醇160mL，计入无水乙醇后及时做好标记，在310μg的Carrier RNA中加入310μL AVE，并颠倒混匀使Carrier RNA充分溶解，就此完成洗液AW1、洗液AW2和Carrier RNA配置，而后通过传递窗传送到样本处理区，或者由人送到核酸提取实验室中。

　　二、样本的裂解

　　用1.5ml的无菌EP管，移液器移取560μl AVL裂解液，加入5.6μl Carrier RNA，加入140μl的已灭活的待提取核酸的待测样本，涡旋振荡15s，室温静止10min。将上述EP管放入离心机内瞬时离心以去除可能残留在EP管盖上的裂解产物，防止污染。裂解完成后，加入560μl无水乙醇，振荡混匀15s，将上述EP管放入离心机内瞬时离心以去除可能残留在EP管盖上的裂解产物，防止污染。

　　向离心柱加入裂解产物630μl，8000转离心1min，若离心机在生物安全柜之外，每次使用都需进行外表面消毒。更换新废液收集管，要从离心机中小心取出离心柱，将上层离心柱转移到新收集管中，继续将剩余裂解产物630μl加入离心柱中，若样本体积大于140μl时需重复此步骤，直到全部裂解产物都过柱离心，8000转离心1min，小心将离心柱转移到新的收集管中。

　　取500μl AW1加入离心柱中（注意，此处加样操作时务必将移液器吸头接触离心柱内壁缓慢加样），8000转离心1min。小心取出离心柱，更换新的收集管。

　　取500μl AW2加入离心柱中，14000转离心3min，小心取出离心柱，更换新的离心柱上端收集管，置于离心机中使用大转速离心1min，以确保将AW2中的残液*离心干净。

　　取无菌1.5mlEP管收集核酸，将离心柱上端小心放入1.5mlEP管中，取40-60μl的洗脱液AVE加入到离心柱中（注意：洗脱液应尽量全部覆盖住离心柱膜），用EP管管盖盖住离心柱，使用无菌剪刀剪去原离心柱管盖。

　　室温静止1min，将其放入离心机中8000转离心1min，回收核酸。丢弃离心柱，EP管中即为获取的提取核酸，做好标记与登记。

　　四、用仪器提取核酸

　　首先按照说明说准备核酸提取试剂，将200μl灭活样本添加到核酸提取试剂中，根据核酸提取仪的设置程序上机提取核酸，等仪器操作结束，提取核酸完成，回收核酸。

　　五、PCR体系配置

　　根据检测样本数量配制体系，将配制好的PCR体系充分混匀并离心后，将其通过传递窗送至样本处理核酸加样区，或单独的样本加样实验室。按照每孔分装20μL反应体系，进行分装，在各孔分别加入5μL待测样本核酸或阴阳对照物（请注意每次检测器包含1个阳性对照和3个阴性对照且阴性对照需随机分布），密封PCR管，有条件时模板加样尽量在单独的生物安全柜进行。

　　工作人员将配好的PCR管通过传送窗口送至PCR扩增区，或由人送至PCR扩增实验室，上机检测。

　　六、上机检测及结果分析

　　工作人员进入基因扩增分析实验室，从传递窗取出PCR反应管，上机前需混匀并离心反应体系，按试剂盒说明说设置扩增参数并分析判读结果。分析结果时，严格阅读说明说充分了解试剂盒灵敏度、方法学局限性等综合判读实验结果。

　　为防止扩增污染，反应结束后的PCR扩增管严禁开盖并装入密封带中装入的垃圾桶中。

　　七、检测后的消毒处理

　　样本处理完成后，工作人员应用75%的酒精消毒处理外层手套并脱下外层手套，放入生物安全柜中的生物垃圾桶中。检测完成后，生物安全柜台面和地面应用0.5-1%的有效氯消毒剂或75%乙醇进行擦拭。将安全柜内产生的医疗垃圾用三层垃圾袋密封，并将其放入垃圾桶中，垃圾袋上需标记医疗垃圾信息。实验结束后，生物安全柜以及实验室均要进行紫外灯照射消毒，时间至少30min。

　　实验操作人员，应有他人用0.5-1%的有效氯消毒剂或75%乙醇对一次性隔离衣均匀喷雾消毒处理，而后脱去隔离衣将检测医用垃圾放入制定垃圾桶中，工作人员在离开二级实验室后，应在缓冲区或走廊按顺序摘脱个人三级防护用品，首先应带新的外层手套，摘掉护目镜并置于75%乙醇中消毒，自上而下、自内向外翻转脱掉一次性防护服，脱去外层手套，摘除、一次性帽子、脱一次性鞋套。脱掉手套，病毒防护服均需进行高压灭菌处理。高压前后医疗垃圾严格区分。

　　病毒相关垃圾需在120度，30min条件进行湿热高压处理，以高压试纸条变色为有效，而后作为普通医疗垃圾处理。