一、原理差异

免疫组化：融合了免疫学原理（抗原抗体特异性结合）和组织学技术（组织的取材、固定、包埋、切片、脱蜡、水化等），通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素)显色，来对组织（细胞）内抗原(多肽和蛋白质)进行定位、定性及相对定量的研究(主要是定位)。样本是细胞或组织，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。要在显微镜下观察结果，可能出现膜阳性、质阳性和核阳性。

免疫印迹（immunoblotting）又称蛋白质印迹（Western blotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。先要进行SDS-PAGE，然后将分离开的蛋白质样品用电转仪转移到固相载体上，而后利用抗原-抗体-标记物显色来检测样品，可以用于定性和半定量。结合化学发光检测，可以同时比较多个样品同种蛋白的表达量差异。

二、实验目的

免疫组化 IHC / IF / ICC ——蛋白定位检测分析

1.定位较直接准确

2.定性灵敏度高

3.半定量（高质量染色，背景浅，特异性强的切片；表达量较多的蛋白）

免疫印迹试验 Western blot

1.测样品内蛋白含量，定量较IHC更准确

2.定性和间接定位，敏感性远远低于免疫组化技术

三、实验准备

（一）免疫组化实验样本
（新鲜，固定方式，充分脱水，防脱处理）

1.取材新鲜，及时固定：防止离体太久而发生组织自溶长菌，抗原扩散或丢失，易保存

2.固定液：

（1）醛类：形态结构保存好，穿透性强，组织收缩少；醛基与蛋白氨基交联形成羧甲基，使抗原决定簇不能充分暴露，需要抗原修复

- 4%多聚甲醛（常用，适用大多数组织，细胞）

- 10%福尔马林/甲醛（常用，脂肪类，脊髓类）

-戊 二 quan（微细结构保存好，用于电镜）

（2）醇类：穿透性强，脱水性强，易引起组织收缩，使蛋白变性作用轻，抗原可流失。

-乙醇，甲醇

（3）其他固定剂

-丙酮，抗原保存性好，脱色性更强，常用于部分细胞爬片

-混合固定剂，Bouni 液，Zamboni液，AAF液等

固定时间：醛类建议24小时以内，醇类，丙酮2小时以内，组织大小厚度略有差异

3. 充分脱水：保存时间长，防止裂片，保持组织结构，防止冰切形成冰晶

4. 防脱处理：防止掉片，多聚赖氨酸防脱切片，明胶和硫酸铬钾处理等

免疫组化切片类型

1.石蜡切片

易保存（干燥低温4~8℃保存），厚度3~6um，结构形态好，需要抗原修复，抗原活性偏低（烤片，固定等）

2.冰冻切片

不易保存（-80℃保存半年），厚度10~20um，形态结构较差，抗原活性高，不一定抗原修复，胞内核内抗原需打孔

冰冻切片是否需要抗原修复？如何固定？

（1）不能及时切片染色观察：可选择固定（24小时内）后切片，需要修复；或马上包埋切片后固定（10 min以内），可修复可不修复

（2）马上切片染色观察的，可不固定，可不修复

3.细胞爬片（贴壁，半贴壁，悬浮）

单层细胞，均匀爬片，选择合适的固定方式保证细胞形态，细胞周期同一化，不需要修复---培养皿/平板 ---盖玻片爬片

（二）实验准备-WB实验样本

1.新鲜制备，低温 裂解 （全蛋白，不包括核抽提、亚细胞器分离等）

2.裂解液，蛋白酶抑制剂，磷酸酶抑制剂

3.研磨（组织），液氮（小体积组织），超声波（细菌/细胞）

4.跑胶，蛋白定量

注意事项：

1.防止蛋白降解，磷酸化蛋白防止去磷酸化

2.浓度低蛋白量少不易检测，浓度高裂解液粘稠不易吸取

3.分泌型蛋白，无血清细胞培养收集上清，TCA沉淀富集